巨噬细胞

巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。

 

刺激巨噬细胞做它该做的清道夫工作，即可清除老鼠大脑中的脑斑。脑斑是蛋白质的堆积物，是老年失智症的病征之一。巨噬细胞是扮演清道夫角色的免疫细胞，巨噬细胞中的合成物转型生长因子贝他（TGF-beta），具有抑制巨噬细胞活动的功能，以免产生失控反应。

老年失智症的大脑，均有转型生长因子贝他浓度升高的现象。科学家认为转型生长因子贝他浓度偏高，是因老年失智症的脑斑会引起发炎，而转型生长因子贝他增加，是为减轻发炎，但新的实验结果显示，情况并非如此。

科学家以基因改造的方式，让老鼠的转型生长因子贝他，无法对在外周循环中的巨噬细胞发出讯号。科学家发现，如此做后，外周循环的巨噬细胞会大举进入老年失智症老鼠的大脑中。

康乃狄克州耶鲁大学医学院陶恩说，外周循环巨噬细胞渗透大脑的动作，即是老年失智症老鼠的疗方。这项结果大出陶恩意料。之前科学家的论点是，提高大脑的免疫反应可能加重发炎，因而对病情有害。实验中，基改老鼠的脑斑有九成消失无踪，而且老鼠的官能反应也获得改善，例如走迷宫不再那么容易迷失方向。陶恩说，若科学家能以药物，封阻人体外周循环中的转型生长因子贝他，应该也能达到动员外周巨噬细胞进入大脑，清除老人斑的目的。陶恩的研究团队已将研究重心，改为寻找可封阻转型生长因子贝他的药物。

巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P338D1、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用，其法如下：

1、实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml（勿注入肠内）。

2、引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70％酒精中3～5秒。

3、置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。

4、再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。

5、用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。

6、小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g4℃离心10分钟，去上清，加10mlEagle培养基。

7、计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105细胞，其中90％为巨噬细胞。

8、为获取3×105帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。

9、为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle液冲洗1～2次后，再加新Eagle培养液置37℃CO2温箱中培养。

细胞培养是无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁，空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。

常用设施及设备

(1)超净工作台：也称净化工作台，侧流式，直流式和外流式三大类。

(2)无菌操作间：一般由衣间，缓冲间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱，离心机，倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱，冷藏器及消毒好的无菌物品等。

(3)操作间：普通培养箱，离心机，水浴锅，定时钟，普通天平及日常分析处理物

(4)洗刷消毒间：烤箱，消毒锅，蒸馏水处理器及酸缸等。

(5)分析间：显微镜，计算机及打印机等。

培养器皿

常用细胞培养器皿有培养瓶，培养板，培养皿等。常准备量是使用量的三倍。器皿应选择透明度好，无毒，利于细胞粘附和生长的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。常用的器皿有下面几种。

(1)液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液，血清等液体，常用规格有500ml，250ml，100ml等几种。

(2)培养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位，规格有200ml，100ml，50ml，25ml，10ml等几种。

(3)培养皿：用于开放式培养及其它用途。分直径30mm，60mm，120mm等几种。

(4)吸管：常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度称改良吸管，刻度吸管用于移动液体。常用1ml和10ml两种。短吸管也叫滴管，分弯头和直头两种。

(5)离心管：离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿，根据用途不同形态各样，常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。前者分别为50ml，30ml，15ml；后者则多为10ml和5ml。

(6)其它：如三角烧瓶，烧杯，量筒，漏斗，注射器等。

细胞培养温度

维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定而适宜的温度。不同种类的细胞对培养温度要求也不同。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，别细胞仍有恢复可能;当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。相反，温度不低于0℃时，对细胞代谢虽有影响，但并无伤害作用;把细胞放入25-35℃时，细胞仍能生存和生长，但速度减慢；放在4℃数小时后，再回到37℃培养，细胞仍能继续生长。细胞代谢随温度降低而减慢。当温度降至冰点以下时，细胞可因胞质结冰受损而死亡。但是，如果向培养液中加入一定量的冷冻保护剂(二甲亚砜或甘油)，可在深低温下如-80℃或-196℃(液氮)长期保存。

合适的气体环境

气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值。数细胞的适宜pH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长，如成纤维细胞最适合pH是7.4-7.6。每种细胞都有其最适pH值。

一、从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞

1、取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4％淀粉肉汤。3～4天以后收集腹腔细胞。

2、如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从一步开始。放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家兔50～70ml）冰中预冷的无菌PBS-H（含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS）。轻轻按摩腹部5分钟。

3、以下均无菌操作。剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2～3次。合并渗出液于离心管中，4℃离心250×g10分钟，去上清液。

4、用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次4℃离心250×g10分钟，去上清液。用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。

二、家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化

1、取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉动物。仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。以下过程注意无菌操作。小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。

2、分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。

3、分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。使肺组织通过00目的钢丝网，分离单细胞。

4、以下过程均在4℃中进行。分别处理肺泡巨噬细胞和肺组织中的巨噬细胞：离心200×g10分钟，去上清液。轻弹试管，悬浮细胞，加入10ml低渗液（20mmol/LTris,0.75%氯化铵，pH7.4），37℃处理3～5分钟，溶解红细胞。红细胞通常分别占肺泡巨噬细胞和组织巨噬细胞的1％和10％。也可以不用低渗处理，直接在淋巴细胞分离液上分离巨噬细胞。

5、离心200×g10分钟，去上清液。用RPMI-1640培养液洗涤细胞一次。将细胞悬液加在淋巴细胞分离液（比重1.077）上，离心400×g20分钟，收集交界面的巨噬细胞。弃去沉淀的死细胞和红细胞。

6、用RPMI-1640培养液洗涤巨噬细胞2次。台盼蓝染色检测细胞活力和细胞数，将细胞配成所需浓度。此时巨噬细胞活力可达90％以上，巨噬细胞占全部细胞的90％以上。

三、从小鼠脾脏、胸腺和骨髓中分离巨噬细胞

1、用外科方法无菌摘取小鼠脾脏和胸腺，置于盛有预冷RPMI-1640培养液（含1％小牛血清）的平皿中，剪去结缔组织和脂肪。用无菌注射器芯将脾脏或胸腺挤压通过200目的钢丝网，获得单个细胞。

2、离心200×g10分钟，去上清液。用含1％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞配成约1×108～5×108/ml。

巨噬细胞游走抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是集细胞因子、生长因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子。MIF高度保守，在多种急慢性炎症性疾病中发挥多种免疫功能。

MIF参与动脉粥样硬化发病和发展，即斑块形成、动脉损伤后重建、动脉瘤形成、心肌梗死、缺血再灌注损伤等机制。此外，其他形式的心肌功能不全和炎症与MIF参与血管再生有关。从特征和功能方面，MIF显著不同于其他细胞因子，是提高动脉粥样硬化治疗的最主要的靶向。

利用MIF，作为心血管疾病治疗靶向和诊断标志物。第四军医大学西京医院呼吸内科、西安市中心医院和陕西省绥德县医院的研究人员共同完成的研究发现，白藜芦醇可以抑制肺泡巨噬细胞过度释放肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-6（IL-6），为慢性气道炎症的治疗带来了新的希望。

在呼吸系统疾病中，气道炎症的慢性化以及气道的重塑是多种肺部疾病如慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘等的共同病理生理特征，该特征是由多种炎症细胞及细胞因子相互作用所致的气道病变。在病理生理过程中巨噬细胞起着极为重要的作用，巨噬细胞在细菌产物、烟雾等有害成分如甲醛、NO2及其他一些氧化产物剌激下，向肺组织迁移并释放多种细胞因子如TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1等，反过来这些细胞因子又可趋化中性粒细胞、T细胞、嗜酸性粒细胞等向肺组织迁移，这些细胞和炎性细胞因子是引起气道炎症慢性化和气道严重损伤的重要因素。如果能有效地抑制细胞和炎症细胞因子的释放，就会降低及减轻气道的损伤。

为探讨白藜芦醇（Res）对小鼠肺泡巨噬细胞释放细胞因子IL-6、TNF-α的影响，研究人员经从小鼠支气管肺泡灌洗中获得肺泡巨噬细胞，分5组进行培养，各组在培养4、6、12、24小时提取上清液，应用ELISA法测定上清液中IL-6、TNF-α含量。

在LPS刺激下IL-6于12小时达释放高峰，在高峰期随着白藜芦醇浓度的逐步加大，IL-6的含量相应逐渐降低，E组IL-6含量明显低于只有内毒素刺激的A组（P＜0.05）。同样在LPS刺激下TNF-α于6小时达释放高峰，在高峰期随着白藜芦醇浓度的逐步加大，TNF-α含量也相应逐渐降低，而C组、D组、E组TNF-α含量明显低于A组（P＜0.05）。白藜芦醇对小鼠肺泡巨噬细胞过度释放炎症细胞因子IL-6、TNF-α具有明显抑制作用，这为气道慢性炎症的治疗提供了理论依据。

在机体创伤修复过程中，巨噬细胞主要有两方面的作用。

其一，一旦机体创伤活动开始,巨噬细胞就能大量分泌多种生物活性物质以及多种酶类物质，其中生物活性物质又称巨噬细胞源性生物因子，包括多肽转换生长因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、血小板衍生生长因子以及一氧化氮等；酶类物质主要包括胶原酶、弹性蛋白酶、纤溶酶原激活剂等；些生物活性物质直接引导着机体修复的整进程。

其二，巨噬细胞作为炎症阶段的主要吞噬细胞，负责清除机体损伤处组织和细胞的坏死碎片以及病原体等，这些物质对创伤愈合过程都有重要的调控作用。因此，研究创伤修复过程中巨噬细胞释放的细胞因子的种类和含量在创伤后不同时间的变化规律，将可能从分子水平和细胞水平上提供一些与损伤时间相关的标志性变化或依据；而文献报道巨噬细胞吞噬物的变化亦具有与时间相关的特点，巨噬细胞吞噬物在形态上易于观察和检测，这些特征使得巨噬细胞在损伤时间推断过程中具有重要的法医学意义。

巨噬细胞源性细胞因子与损伤时间的关系

创伤修复是一个在时间和空间上受一定的细胞生物因子所调控的复杂生物学过程，其中巨噬细胞分泌的细胞因子在创伤修复中的活跃表达近年来已被中外学者所关注，一些已考虑作为损伤时间推断的有用参数。认为主要参与损伤修复的巨噬细胞源性细胞因子有以下几种。

转化生长因子（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）TGF-β是具有广泛生物学效应的多肽细胞因子，来源于血小板、巨噬细胞、T淋巴细胞、增殖的上皮细胞、成纤维细胞等，参与细胞的增殖分化、代谢和内外间质的形成，在组织创伤、修复、炎症、骨质再生、肿瘤发生等病理生理过程中起重要作用；TGF-β还是一种极强的免疫调节剂，能抑制多种免疫反应，对单核巨噬细胞等炎性细胞具有极强的趋化性。TGF-β通过调节细胞周期因子、转录因子、生长因子、粘附分子和细胞基质基因的启动、转录、降解等环节而实现其促进或抑制细胞生长的功能创缘组织表达。

TGF-β能诱导中性粒细胞和巨噬细胞向创伤部位补充，促进成纤维细胞增殖和细胞基质的合成，并能促进表皮细胞的增殖。TGF-β是再生上皮化的重要标志，是皮肤基质和肉芽组织形成的重要且必不可少的条件，已证实它能影响愈合过程的各个阶段，提供正常愈合的信号物质，其中TGF-β与创伤关系最为密切。此外，TGF-β还促进成纤维细胞趋化，产生胶原和纤维连接蛋白，抑制胶原降解，促进纤维化发生。谢举临等认为TGF-β是创伤修复过程中促进切创愈合的一类强有力的细胞因子，它的表达异常直接影响伤口愈合的时间。

巨噬细胞吞噬物与损伤时间的关系

活体组织受损后，局部可发生出血、坏死，巨噬细胞吞噬组织间隙的血细胞和坏死组织后，吞噬物与胞浆内的溶酶体融合，随损伤时间的延长而逐渐降解，不能分解的物质则在胞浆内形成残留物。BetzP表明，含吞噬物的巨噬细胞如噬脂细胞、噬血红蛋白细胞和噬铁细胞最早在伤后2～3天出现，损伤组织中出现吞噬细胞的时间有部位差别。在人体，脑和皮肤组织出现噬铁细胞的时间于出血后15～17h，而在肺则出现在出血后30min左右。

组织内出血时，从血管中逸出的红细胞被巨噬细胞摄入并由其溶酶体降解，使来自红细胞的血红蛋白的Fe3＋与蛋白质合成电镜下可见的铁蛋白微粒，若干铁蛋白微粒聚集成为光镜下可见的棕黄色，较粗大的折光颗粒称为含铁血黄素。

巨噬细胞破裂后，此色素也可见于细胞外。含铁血黄素因含Fe3＋而被普鲁氏蓝染成蓝色。LaihoK报道，在人体，损伤出血后21～48h皮肤和皮下出现噬铁细胞，4～8天后则多。BetzP等通过研究人体皮肤损伤标本认为，含铁血黄素最早于伤后3天检测到，伤后8天则超过显微镜20%的区域均可见含铁血黄素沉积。据此认为只要20%或以上的检测区域检见含铁血黄素沉积，就可认定损伤时间大约为7天。因此，通过图像分析系统检测巨噬细胞吞噬物推断损伤时间有可能成为一种非常简便易行的方法。

巨噬细胞（Macrophages）能够吞没、破坏受损伤组织，有助于启动康复过程。虽然它们在损伤位点发挥关键作用，但一旦任务完成，就需要尽快撤离，结束炎症反应，为再生过程开路。继续存在的巨噬细胞不利于组织恢复。

尽管研究人员对于启动巨噬细胞的分子机制研究的比较透彻，但关于其退出损伤位点的过程还了解甚少。研究人员鉴别出一清除外周神经损伤位点巨噬细胞的关键环节，对弄清脊髓损伤、中风和多发性硬化中相似的分子机制提供了重要线索。已知Nogo细胞受体家族与神经细胞生长有关，SamuelDavid等观测Nogo家族成员NgR1的作用。NgR1类受体是位于细胞膜上的蛋白开关，受到特异化学信号或配体刺激后，诱导细胞反应。

破坏大鼠、小鼠的大腿坐骨神经，观察NgR1在修复过程中的作用，结果发现巨噬细胞到达损伤位点后，细胞表面会表达NgR1。进一步研究发现，受损神经合成髓磷脂时，NgR1不仅阻止巨噬细胞与髓磷脂结合，而且直接排斥正在形成过程中的髓磷脂，若抑制髓磷脂再生，巨噬细胞会停留在损伤位点周围。最终，研究人员在髓磷脂上鉴别出特异激发排斥反应的分子。可应用于外周神经以外的神经（中枢神经），他们发现中风、多发性硬化和脊髓损伤过程中激活的巨噬细胞，表面都会表达NgR1。

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1、医源世界 http://www.39kf.com/my/tag_1_-32546a32454a22124a24040/
2、北方网 http://health.enorth.com.cn/system/2004/03/09/000746856.shtml
3、生命经纬网 http://www.biox.cn/content/20050603/14708.htm