互补试验

【摘要】目的：探讨核苷酸切除修复交错互补基因?1(ERCC1)在人结直肠癌中的表达水平，分析其与铂类药物化疗敏感性及生存时间的关系.方法：以西安交通大学第一附属医院行结直肠癌根治术患者45例和剖腹探查术患者18例的标本为材料，采用免疫组织化学Elivision法检测其ERCC1表达水平.其中40例复发、转移及晚期患者行草酸铂为基础方案化疗.所有入组患者随访6年.结果：肿瘤组织中ERCC1的阳性率为52.08％，低于对照组.病理分级与ERCC1的阳性率之间有关（P=0.040），病理分级越高，ERCC1阳性率越低，表达强度越弱.ERCC1阴性者铂类药物化疗有效率为60.00%(12/20)，而阳性者则为25.00%(5/20)，二者之间具有统计学差异（P=0.025）；Cox回归分析显示ERCC1表达为结直肠癌患者独立预后因子（P=0.048）.结论：ERCC1表达可作为预测结直肠癌患者对铂类药物敏感性及预后判断的指标之一.

【关键词】结直肠肿瘤;核苷酸切除修复交叉互补基因?1;免疫组织化学;耐药;草酸铂

　　ExpressionofERCC1incolorectalcanceranditsclinicalsignificance

　　ZHUJuan,XIAOJu?Xiang,ZHANGYan?Bing,WANGYan?Hua,CHANGHao,WUJun?Lan,ZHANGLei,WANGLe

　　DepartmentofMedicalOncology,FirstHospitalofXi?anJiaotongUniversity,Xi?an710061,China

　　【Abstract】AIM:Toexploretheexcisionrepaircross?complementing?1(ERCC1)expressionlevelinhumancolorectalcarcinoma,andanalyzeitsrelationshipwiththesensitivityoftheplatinumdrugsanditsprognosis.METHODS:Sixty?threearchivedsamplesofthepatientswithcolorectalcarcinomaweredetectedbyimmunohistochemicalstaining(Elivision).Forty?fivepatientsunderwentradicalsurgicaltreatmentand18patientsexploratorylaparotomy.Allpatientswerefollowedupfor6yearsaftertheoperation.Fortyadvancedcaseswithrecurrenceandmetastasisreceivedoxaliplatin?basedchemotherapy.RESULTS:Inthese63patients,thepositiveexpressionrateofERCC1was52.08％,significantlylowerthanthatinthecontrolgroup.Thepositivityratewascorrelatedwithcolorectalcancerhistologicgrade(P=0.040).Thehistologicgradehigher,thepositiverateofERCC1lower,theexpressionintensityweaker.Inusingoxaliplatincases,theresponserateoftheERCC1negativegroupwas60.00%(12/20),thatoftheERCC1positivegroupwas25.00%(5/20).TherewassignificantcorrelationbetweentheexpressionofERCC1andtheefficacyofchemotherapy(P=0.025）.TheERCC1wasanindependentprognosticfactorofcolorectalcancerbytheCOXregressionanalysis(P=0.048).CONCLUSION:ERCC1expressionmightbeoneofthepredictionmarkersofthedrugsensitivityoftheplatinumdrugsandofprognosisincolorectalcancer.

　　【Keywords】colorectalneoplasms;ERCC1;immunohistoche?mistry;resistance;oxaliplatin

　　0引言

　　DNA修复异常与肿瘤发生、肿瘤多药耐药性［1］均有密切联系.其中核苷酸切除修复系统(nucleotideexcisionrepair,NER)是机体抵抗致癌效应的主要防御机制，也是修复化疗药物所致DNA损伤的主要机制.核苷酸切除修复交错互补基因?1（excisionrepaircross?complementing?1,ERCC1)是NER的限速酶，起着损伤部位的识别和DNA链5′-3′核酸内切酶的作用，与多种肿瘤发生及铂类药物耐药有关系.以铂类药物为基础的联合化疗是结直肠癌综合治疗的重要手段之一，耐药是导致患者治疗失败的主要原因.我们通过检测结直肠癌石蜡包埋组织中ERCC1的表达，分析其与临床生物学特点及铂类药物化疗效果的关系，探讨ERCC1在结直肠癌发生中的意义，并提供一个可逆转耐药的指标.

　　1对象和方法

　　1.1对象

　　选取2000?03/2001?03在西安交通大学第一附属医院行结直肠癌根治术患者45例和剖腹探察并减瘤术者18例，共63(男36，女27)例，年龄24~75(平均54.56)岁.部位：结肠27例，直肠36例.TNM分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期20例，Ⅲ期21例，Ⅳ期18例.Ⅱ期及以上期别临床资料完整的患者59例术后均给予化疗.辅助化疗患者41例均采用含5?Fu/CF方案（5?Fu425mg/m2,iv，第1~5日+CF200mg/m2,iv，第1~5日），其中有24例复发转移后进行了含草酸铂的FULFOX4方案治疗(Oxaliplatin85mg/m2静脉滴注，2h，第1日；CF200mg/m2，iv，2h，第1,2日；5?Fu400mg/m2推注，然后600mg/m2持续静脉滴注22h，第1,2日).18例晚期患者采用上述FULFOX4方案化疗16例，5?Fu/CF方案2例.疗程3～6周期，平均疗程4.75周期.对有可测量病灶者采用WHO统一标准进行疗效评价，观察生存期，若末次随访仍然存活则定为截尾值.随访至2007?05，随访率为98%，其中死亡42例.收集同期行肠镜检查病理诊断为正常的结直肠黏膜标本10例，作为正常对照；结直肠癌标本中非癌组织的部分10例，作为癌旁组织对照.

　　1.2方法

　　1.2.1免疫组化检测ERCC1的表达取上述库存蜡块切成5μm厚切片，常规脱蜡至水，用免疫染色Elivision法，DAB显色进行ERCC1相关抗原的免疫组化染色.试验中一抗为1∶100稀释的小鼠抗ERCC1单克隆抗体，二抗为即用型第二代免疫组化ElivisionTM加光谱试剂盒，均购自福州迈新生物技术开发公司.以福州迈新生物技术开发公司提供的阳性对照片作为阳性对照；以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照.

　　1.2.2结果判定本实验结果判断标准参照Fromowitz等［2］综合计分法，由阳性着色细胞所占百分数与细胞着色强度二者结合起来计算.阳性细胞百分数为10个视野阳性细胞的平均数占这10个视野中细胞数的百分比：<5%计0分；5%~25%计1分；26%~50%计2分；51%~75%计3分；>75%计4分.细胞着色强度：不着色计0分；淡黄色计1分；棕黄色计2分；棕褐色计3分.二者积分相加：0~1分为阴性，2分为阳性.

　　统计学处理:用SPSS13.0统计软件包行Chi?Square检验，Kaplan?Meier比较生存曲线，并经log?rank检验，P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1ERCC1的表达ERCC1主要分布于肿瘤细胞胞核中，色黄，分布均匀，颗粒细(图1)；某些细胞质中也有表达（图2），集中于核膜周围.人结直肠癌组织中ERCC1阳性率为52.38%；癌旁组织中阳性率为80.00%；正常结直肠粘膜组织中阳性率为90.00%.经统计学分析，癌组织与癌旁组织、正常组织中ERCC1的阳性率有差异（P值分别为0.017,0.014）；正常组织与癌旁组织无显著性差异（P=0.523）.癌组织中ERCC1低水平表达.

　　2.2ERCC1与结直肠癌患者生物学特点的关系

　　63例结直肠癌标本中，病理学分级为Ⅰ级者11例，阳性率81.81％；Ⅱ级者34例，阳性率52.94％；Ⅲ级者18例，阳性率33.33％.经统计学分析，病理分级与ERCC1表达之间有关（P=0.040）.病理分级越高，ERCC1阳性率越低，表达强度越弱.ERCC1表达与性别、年龄、部位、分期无关（表1）.表1ERCC1表达与结直肠癌生物学特点的关系（）

　　2.3ERCC1的表达与化疗疗效之间的关系

　　59例化疗患者中可评价疗效者42例.其中草酸铂组40例，总有效率为42.50％（17/40）；ERCC1阴性者化疗有效率为60.00%(12/20)，阳性者有效率为25.00%(5/20).二者之间具有统计学差异（χ2=5.013，P=0.025），ERCC1阴性者化疗有效率高于阳性者.

　　2.4ERCC1表达水平与预后的关系

　　ERCC1表达阳性与阴性患者的生存曲线分析显示ERCC1阴性患者5a生存率为53.33%,ERCC1阳性患者为27.27%，具有统计学差异(χ2=4.459，P=0.035).Cox回归分析显示ERCC1表达（P=0.048）为结直肠癌患者独立的预后因子（图3）.

　3讨论

　　NER系统是DNA最主要的修复机制，其功能异常在多种肿瘤的发生、发展过程中起重要作用［3］.ERCC1在NER系统中起着损伤识别和核酸内切酶的双重功能，其表达水平可以代表NER系统的活性.ERCC1基因是利用对紫外线敏感的中国仓鼠细胞（CHO）和人类瘤细胞株进行细胞融合和互补试验而克隆出的一种与紫外线敏感的突变型鼠细胞互补的人类修复基因，定位于染色体19q13.2，共有四种分子量的mRNA，但只有111kb的mRNA表达出Mr为33000~36000的蛋白时，才表现其功能.根据Ted等［4］的文献报道，ERCC1基因属于肿瘤抑制基因中的看家（caretakers）基因的一种.

　　文献报道在卵巢癌的研究中发现恶性程度更高的透明细胞癌中ERCC1表达比其他病理类型表达更加低下，说明了ERCC1的表达与细胞分化程度有关系，分化程度越差，修复功能越低下［5］.Saeb?等［6］对156例结肠癌患者组织和399例正常者进行对照后发现，二者之间ERCC1的表达存在差异（P=0.011）.Kwon等［7］通过免疫组化法检测64例进展期胃癌患者组织中ERCC1,TS和GSTP1的表达，发现ERCC1阳性对FULFOX方案化疗的敏感性显著低于阴性患者（P=0.045）.逯晓波等［8］通过构建包含ERCC1基因的表达载体,转染UV20细胞后，通过细胞抑制率测定(SRB)评价草酸铂的细胞毒作用，发现获得转染成功的UV20?ERCC1细胞,ERCC1表达水平增加与草酸铂敏感性降低密切相关.Azuma等［9］通过免疫组化法检测67例肺癌患者组织中ERCC1,P53及TRK的表达，发现ERCCI阴性患者中位无进展时间和总生存时间均高于阳性患者.本研究结果与文献报道结果一致，说明在结直肠癌中，ERCC1表达可作为预测草酸铂化疗敏感性的指标之一.其主要机制可能为铂类药物作用后，受损细胞周期阻滞在G2/M期，而ERCC1过表达可使停滞在G2/M期损伤的DNA迅速修复，受损肿瘤细胞存活增多.

　　近年来,通过反义RNA干扰ERCC1mRNA的表达以及其他用分子生物学手段作用于ERCC1可以逆转铂类药物耐药.Selvakumaran等［10］通过反义RNA方法作用于对顺铂敏感的A2780细胞系和顺铂高度耐药的OVCAR10细胞系的ERCC1基因，使得耐药株的IC50值明显下降.刘国艳等［11］通过RNA干扰技术抑制卵巢上皮性癌ERCC1，发现能增加卵巢癌细胞ES?2对顺铂的敏感性.今后有望通过干扰ERCC1的表达来提高铂类药物化疗疗效.

【参考文献】
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　植物生物技术实验室是中国科学院植物生物技术开放实验室的一部分，同时也是国际科学和文化中心世界实验室中国植物生物技术分部和新加坡－中国生物技术合作项目北京研究部。该实验室的研究方向是从我国农业生产的需要出发，开展分子生物学及植物生物技术的应用基础研究。2003年、2002年、2000-2001年发表论文情况

主要研究内容为：

1．植物重要病原体（病毒、细菌、真菌）基因组学和病原体－植物的相互作用；

2．与植物重要农艺性状相关的基因的结构和功能；

3．植物基因表达调控；

4．抗病、抗虫、耐逆等转基因植物的研制及生物安全性；

5．利用植物生产药用蛋白、疫苗和保健性产品。

实验室有固定人员17人，其中正研究员（博士生导师）5名（包括中科院院士1名），副研究员4名，高级实验师3名；博士后1名，博士生23名，硕士生3名，客座研究和进修人员15名。

1．植物转基因的表达调控

负责人：方荣祥院士

(1)胡萝卜口服轮状病毒亚单位疫苗的研制。

轮状病毒是导致婴幼儿重症腹泻的主要病原，但目前尚缺乏有效、安全的疫苗。出于安全性的考虑，国际上曾试验过源自动物的轮状病毒疫苗或动物病毒与人病毒的重配疫苗，但由于在婴幼儿试验中发生肠套迭而被停止使用。病毒亚单位疫苗有较好的安全性。

轮状病毒VP4、VP7能诱发中和性抗体，VP6是一个高度保守和免疫性强的蛋白。用胡萝卜生产轮状病毒亚单位疫苗具有耐贮运、可直接口服等优点。我们构建了35S-VP4、35S-VP6、35S-VP7植物表达载体，并已获得了相应的转基因胡萝卜植株。我们还克隆了胡萝卜直根特异表达的II型转化酶基因（invII）启动子以构建胡萝卜直根特异表达轮状病毒抗原蛋白的表达载体，并建立了真空渗入法在胡萝卜直根中测定invII启动子活性的方法。对invII启动子2760bp、1234bp、634bp、250bp等一系列5′缺失片段的活性分析表明，634bp和250bp片段的活性较高。目前正在进一步构建活性增强的invII启动子。

农杆菌真空渗入法分析invII启动子在胡萝卜直根中的活性

(2)野油菜黄单胞菌新的群体感应系统的验证。

群体感应（Quorumsensing,QS）是一种细菌细胞与细胞间的通讯系统，即细菌通过可扩散的小分子信号分子感知细胞群体的密度，从而引起一些特定基因在细菌群体中的协调表达。QS系统调控细菌许多重要的生理功能，包括生物发光、Ti的接合转移、生物膜的形成、对寄主的致病性等。在大部分革兰氏阴性菌中，QS基因表达调控系统至少包括信号分子酰基高丝氨酸环内酯（AHL）、与AHL结合后活化的转录因子（LuxR及其类似物）及与转录因子相结合的目标基因启动子中的顺式元件（lux-box）。在一些革兰氏阳性菌中，信号分子为寡肽。与其他革兰氏阴性菌不同，在野油菜黄单胞菌（Xcc）中并未发现AHL，而可能是利用一种可扩散信号分子（DSF）参与QS调控Xcc的致病性。DSF的结构新近已被我们的合作者阐明，证实为反-11-甲基-乙-十二烷酸。然而我们通过对Xcc全基因组序列的分析，发现存在一个单拷贝的与luxR同源的ORF，其下游紧邻一个编码脯氨酸亚氨基肽酶（PepIP）的ORF，在这二个ORF之间存在一个类似于luxbox的20bp的反向重复序列。基于以上生物信息学分析，我们推测Xcc中可能存在以寡肽为信号分子、LuxR为转录因子、PepIP参与信号分子合成或降解的调控Xcc致病性的QS系统。为验证该QS模型，我们已构建了Xcc的luxR-或pepIP-突变株，发现它们丧失了对甘蓝寄主的致病性。我们还分析了突变株的与致病性相关的胞外淀粉酶、胞外纤维素酶、胞外蛋白酶的活性及胞外多糖的性质。我们拟进一步的进行遗传学和分子生物学实验来阐明Xcc是否存在这种新的QS系统。

(3)水稻黄矮病毒P3蛋白可能是一个运动蛋白。

大多数植物病毒编码运动蛋白（MP）负责病毒在细胞-细胞间的移动。然而在具有负链RNA基因组的植物弹状病毒中尚未鉴定出具有MP功能的蛋白。水稻黄矮弹状病毒（RYSV）基因组共编码7个蛋白，除了功能已较清楚的N、P、M、G和L蛋白外，P3和P6的功能尚未明确。P3分子量为32.7kDa，与已知的植物病毒MP30K超级家族成员的大小相近。蛋白的二级结构预测表明，P3中有4个含α-螺旋结构的区域，在α螺旋区间存在6个含b片层的区段，这种二级结构域的分布与30K超级家族的共有结构相似。而且P3中也存在30K超级家族成员中共有的氨基酸序列LXDX50-70G。为分析P3是否具有MP的特性，我们进行了P3与RYSV在细胞间移动的单位－核蛋白复合体（RNP）中的核衣壳蛋白N和病毒RNA结合的试验。Northwestern实验表明，E.coli表达的P3蛋白能与RYSVRNA的5′端trailer序列和3′端leader序列相结合，也能与其他非病毒来源的单链RNA结合，说明P3具有与单链RNA结合的能力。我们用GST-pull-down实验证明35S-Met标记的P3蛋白能与GST-N融合蛋白结合，但不能与GST蛋白结合，说明P3能与RYSVN蛋白特异结合。对P3蛋白做了一系列的N端或C端的缺失，GST-pull-down实验表明P3蛋白第60-153氨基酸区段包含有与N蛋白结合的基序，实验中所界定的能识别N蛋白的最小区段位于第60-90个氨基酸之间。上述结果表明P3可能是RYSV中的运动蛋白。　　

 

2．与植物重要农艺性状相关基因的结构和功能

负责人：夏桂先研究员

(1)纤维细胞特异表达基因的分离鉴定及功能分析

棉纤维细胞是研究植物细胞伸长和纤维素生物合成的理想模式系统。迄今对控制纤维发育的关键基因还知之甚少。我们通过FDD方法，克隆了一个在棉纤维细胞内特异表达的受体类蛋白激酶基因（命名为GhRLK1），在纤维发育过程中，该基因仅在纤维伸长停止和次生壁大量合成阶段表达。

根据受体类蛋白激酶基因在控制植物发育过程中的诸多重要功能，以及GhRLK1的这种表达特征，我们推测该基因在控制纤维细胞的伸长和次生壁纤维素合成的信号转导过程中具有重要作用。

我们还利用抑制扣除杂交等方法，克隆了另几个棉纤维细胞特异表达基因，如G－蛋白偶联受体蛋白基因和锌指蛋白基因等，现正在对这些基因进行功能鉴定。

 

(2)盐芥耐盐相关基因的克隆

盐芥是极端耐盐的十字花科植物,由于有着与拟南芥相似的多种优点（基因组小、生活史短、产种子多，容易转化等），小盐芥被认为是研究植物耐盐机理的模式盐生植物。我们以裂殖酵母为一简单的功能体系，通过盐芥基因在酵母细胞中过量表达对酵母耐盐性的影响，分离鉴定了多个耐盐相关基因（如GTP-结合蛋白基因,膜蛋白基因等），并对其中几个基因的表达特征进行了重点分析。现正在通过转基因植物分析这些基因的表达对植物耐盐性的影响。

(3)烟草BY－2细胞胞质分裂调控基因的分离

由于酵母细胞与真核生物的细胞周期调控机制具有相似性，我们尝试以裂殖酵母为试验体系，通过烟草BY-2细胞基因在酵母细胞中过量表达对酵母细胞周期的影响，分离鉴定BY-2细胞的胞质分裂相关基因。现已获得多个候选基因，正在对其进行功能验证。

3．植物-病原物的相互作用

负责人：何朝族研究员

1.植物抗病信号传递途径的研究

(1)水稻假病斑基因spl1突变体基因的克隆。

水稻假病斑基因spl1是由一对隐性基因控制。其表型是自发产生类似于病斑的假性病斑。spl1基因能增强水稻对稻瘟病的抗性。利用图位克隆法克隆该基因。我们建立了3202个后代分离群体（2950个spl1表型）。已找到10个和spl1基因紧密连锁的CAPS分子标记，分布在12号染色体约8.8cM的区域，通过筛选这些分离群体,发现其中一个分子标记同spl1基因未发生交换，说明其位于基因区域。

在该分子标记一侧的7个分子标记显示不同数量的重组子。而另一侧的2个分子标记显示2个不同的重组子，由此构建了Spl1基因的遗传图谱和物理图谱，确定了基因位于两侧最近的2个markers之间约423kb。通过PCR和Southern分析7个spl1等位突变体，表明其中四个突变体丢失的左边界在markerAl951a后，而丢失的右边界，一个突变体在Al760后，三个突变体在Al874a和Al760之间。由此确定了基因在两个BAC克隆上的70kb范围，位于水稻第十二号染色体的短臂上接近于着丝点。现正确定Spl1候选基因，并同7个等位突变体比较和做互补试验，最后克隆出spl1基因。

(2)水稻细胞程序死亡基因OsLSD1的功能研究

拟南芥LSD1基因编码一个含有三个锌指结构域（zincfingerdomain）的负调控因子，推测LSD1蛋白通过转录调控，抑制拟南芥的prodeathpathway或激活antideathpathway，从而调控拟南芥类似HR的细胞死亡。LSD1突变体的假病斑表型在长光照条件下才表现出来，是隐性突变。该突变体对细菌和真菌表现为非特异性抗性。研究表明，超氧化物(superoxide)是突变体lsd1假病斑形成的主要因素。我们通过对水稻EST的测序与分析，获得一个与拟南芥LSD1基因同源性很高的水稻cDNA，并将该基因命名为OsLSD1（OryzasativaLSD1）。。Southernblot分析表明，该基因为单拷贝基因。为了初步了解该基因与水稻抗病的关系，对该基因在水稻接种稻瘟病菌后的表达情况进行了Northernblot分析，结果表明OsLSD1基因受稻瘟病菌抑制，在接种稻瘟病菌4小时后几乎消失，48小时后再度出现，且表达量比接种前有所提高。这一表达模式与植物（包括水稻）PR（pathogenesisrelatedproteins）蛋白的表达模式相反。从OsLSD1的结构和表达模式上，初步推测该基因是拟南芥LSD1基因的同源基因，估计该基因在水稻抗病和细胞程序死亡上有重要意义，值得深入研究。

(A)获得转基因水稻植株并进行初步的表型鉴定

从开始分化到出苗，可以看出sense与antisense、对照pCAMBIA1301明显不同，sense转至分化培养基上三天即变绿，而后两者一般需要10天左右。sense的出苗率为68.5%,明显高于antisense的46.1%和pCAMBIA1301的49.6%。另外，antisense转基因苗长势很弱，根系不发达，叶片在无菌条件下易发生病斑，有些逐渐导致整株死亡。初步推测OsLSD1基因与水稻转基因分化和程序性细胞死亡有关。分别采取三种转基因水稻叶尖部分，Trypanblue染色后用解剖镜观察。可以看到sense和antisense病斑部位。T0代植株的Southern杂交结果表明OsLSD1基因以单拷贝，2个或3个拷贝等方式整合到水稻染色体中。

(B)OsLSD1转基因水稻后代分子分析和表型鉴定

通过Northern杂交，选择3个外源OsLSD1基因大量表达的正义（sense）转基因系和5个OsLSD1基因反义（antisense）大量表达的系用于进一步分析。以仅含有pCAMBIA1301载体的水稻转基因系和野生型日本晴为对照。

在自然条件下，5个antisense系中有3个表现出假病斑表型。Northern杂交结果表明PR-1基因在产生病斑的植株中得到大量表达。对sense,antisense转基因植株和对照进行稻瘟病毒性小种Y34接种。对照表现出典型的发病症状，而sense,antisense则均表现出明显的抗性，其病斑与HR反应类似。OsLSD1基因的克隆将有助于理解水稻抗稻瘟病的分子机理。

构建了OsLSD1-GFP融合基因的表达载体。用该载体转化烟草BY-2悬浮细胞，结果表明OsLSD1定位于细胞核。另外，OsLSD1-GFP转基因烟草植株也表明OsLSD1位于细胞核。

转基因系的T2代种子再生实验证明OsLSD1基因的表达能够促进愈伤分化，提高分化率,与水稻愈伤转化结果一致。

以上结果表明OsLSD1是一多效性功能蛋白。它可能作为程序性细胞凋亡的负调节子，在植物与病原菌相互作用中发挥重要功能。另外，OsLSD1能够促进愈伤分化和提高转化率，提高植物叶绿素含量，对稻瘟病有持久抗性。该工作成果已申请专利一项。

4．抗虫基因及其植物基因工程

负责人：田颖川研究员

(1)抗虫转基因棉花的研究及其生产性试验

对转BtCry1Ac和ApI-B基因抗虫棉纯合系DR409等进行了生产性试验，跟踪检查了两个抗虫基因及其功能的遗传稳定性，结果表明抗虫基因能稳定遗传、抗虫性稳定。对这些纯合系的农艺性状，纤维品质进行了调查，结果表明抗虫纯合系的结铃性、纤维比强明显高于原转化受体冀合321。

另外，还对抗虫棉对非目标昆虫的影响，标记基因的环境漂流率、抗虫棉的自然竟争性进行了调查。动物毒性试验和生产性试验结果表明转双基因抗虫棉对动物和环境是安全的，与非转基因对照棉花产品在安全性方面无明显差异，应属“实质等同”物质。

DR409已获农业部批准在山西省进行生产应用的安全证书，为山西省的品种审定作好了准备。同时转CrylAc基因的抗虫棉BR-98-2已获准在山西、湖北进行生产性试验。另外，转BtCry1Ac和GNA基因的新疆彩棉及湖南湘棉进行了中间试验，田间抗虫效果明显。

(2)抗蚜转基因棉花的研究

用雪花莲凝集素（GNA）基因及有潜在抗蚜作用的尾穗苋凝集素（ACA）基因构建了韧皮部特异表达的单基因（pBCACA和pBdePACA）及双抗蚜基因植物表达载体（PBACG）。含有这些表达载体的农杆菌转化子已交合作单位开展棉花的转化，同时我们正在用转基因烟草研究这些基因组合的抗蚜效果。用含pBCACA或pBdEP-ACA的农杆菌转化了冀合321等棉花品种,从105株转化再生植株中经移植、PCR检测和抗蚜性调查及农艺性状观察选出PCR阳性且蚜虫危害较非转基因对照减轻50%左右的株系9个。田间蚜害调查和PCR检测等结果表明，所选到的转基因株系的抗蚜性达到50%左右，现蕾期转基因棉花对棉蚜的抑制率一般高于苗期，由于这些株系还未达到转基因纯合，所以通过进一步的子代筛选，其抗蚜性还可能有所提高。除以上9个株系外还有21个PCR阳性T0代植株待进行抗蚜性筛选。

用转pBACG的50多株烟草植株进行抗虫试验结果表明蚜虫的平均抑制率可达83.9%，其中抗蚜活性在90%以上的占参试植株总数的58%，与转单一抗蚜基因（GNA或ACA）的烟草（别为70%和75.3%）相比，这些表达两个基因烟草的抗蚜性有比较明显的提高。

(3)种子特异启动子的分离及植物表达载体的构建

基于苋菜凝集素（ACA）及其mRNA主要存在于苋菜种子内的事实，通过TAIL-PCR扩增了ACA编码区上游的650bp的调控序列。对克隆序列进行DNA序列分析结果证明其具有启动子的基本基序及控制种子特异表达的基序，即符合种子特异启动子的结构特点。为研究该启动子在异源植物中的表达特点及可能的应用价值构，建了该启动子-GUS嵌合基因的植物表达载体。

http://www.im.ac.cn/jg/lab/shiyanshi_2.htm