细胞脱核技术

细胞脱核指人工将核从细胞中除去，是发展的新技术，细胞经松胞菌素B(CytochalasinB；CB)以10mg/L的浓度浸没,以12000r/min离心15～20分钟，细胞核可从细胞中分离出来，可使99%的细胞发生脱核，形成无核细胞质体(Cytoplast)和无胞质的核质体(Nucleoplast)，可用于做多种研究，如细胞融合、胞质、胞膜、胞核的成分分析以及开展染色质基因转移技术等。

准备工作
(1)将CB溶于二甲基亚砜中(DMSO)，即1mLCB加1mLDMSO作为母液，4℃可存放三年，使用时以1：100加入培养基中，使其最终浓度为10μg/mL。
(2)培养用的塑料圆板的处理：用无毒的Polystyrene塑料圆板，厚度需1～1.5mm大小可随离心管直径大小而定，只需比离心管口径略小1～1.5mm，圆板两侧要有两个凹陷以便用镊子挟取，为了便于圆板的支撑和平衡离心，在离心管中加入一个圆筒状的塑料垫圈，垫圈高2～2.5cm，周边厚度为2cm，其外径应与圆板的大小相当，使其与离心管的口径略小，在离心管中可方便插入和取出，离心前应先把垫圈投入离心管中，把圆板稳固地扣盖在垫圈上(令其细胞朝下)，然后加入CB液略超过圆板，以浸没细胞。
离心管可用高压灭菌，塑料圆板垫圈可用60CO辐照，也可用95%酒精浸过夜，取出用无菌蒸馏水漂洗2～3次，用紫外线对其两面照射20～30分钟或更长后，即可使用。

脱核程序
(1)用能贴壁生长的单层细胞，取数个塑料圆板置入平皿中，接种已制备好的细胞悬液，置37℃%CO2培养。
(2)待细胞形成单层时，在无菌条件下将细胞圆板扣盖在离心管的垫圈上，令细胞面向下，加入CB(10mg/L)培养基，使其淹没圆板为宜，为了防止圆板离心时翻转，在圆板上再放入同直径的圆柱形垂锤。
(3)有99%细胞的核被脱掉,为防止细胞丢失离心速度不要太高，离心时间不宜太长)。
(4)离心脱核后，沉于管底的为胞核，圆板上的细胞为脱核的胞质体，用PBS漂洗2次，每次1～2分钟可置入培养液基(不含CB)继续培养，使细胞恢复原先的正常形态。取出固定染色，也可进行细胞融合及染色质导入试验，或将胞膜、胞浆分离进行成分分析，或开展膜结构研究。沉于管底的核，因核周围仍包有薄层胞质和CB，可采用培养液漂洗1～2次，然后用于融合，或将核中染色质导入另一新细胞，或吸出涂片，固定，染色，制成标本。

去核即是将受体细胞(卵母细胞)内主要遗传物质彻底清除干净，从而保证由移入的细胞核所发育的个体具有与供核动物最高的相似遗传特性(克隆动物)，并避免重构卵子在后续发育过程中产生染色体的倍性畸形。因此，去核是细胞核移植过程中的一个非常重要的操作步骤，也是核移植成功的关键。通过对小鼠卵母细胞去核结果的分析，以探讨其在核移植过程中的重要性。

1材料与方法
取性成熟的ICR小鼠，自由摄食和饮水，每日光照12h。腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG，5IU／只，天津天孚高新生物技术公司生产)，48h后注射人绒毛促性腺激素(HCG，5Iu／只，上海第一生化药业公司生产)。HCG注射后13～15h，将鼠扑杀，剪下输卵管放入HIF—HEPPES(SUt~公司生产)液中，于输卵管壶腹部处，将输卵管撕开，卵冠丘复合物逸出。用0．1％的透明质酸酶消化颗粒细胞．3～5min后颗粒细胞松散，将卵吸出，在Ⅲ一H液
中反复洗涤．将卵放人HTF—H—CB液中(CB浓度5btg／m1)。上覆石蜡油，10mln后将操作小室放置于倒置显微镜(NiconEclipseTE／300)下进行去核手术。

小鼠去拨采用2步法。第1步：透明带(ZonePellucideDissection，ZPD)切口。由于新排出的卵，其核与第一极体呈对位关系，用固定针将卵母细胞吸住，用切口针扳动卵母细胞使第一极体位于12点处，切口针从1点处穿刺进针经第一极体(Fristpolarbody，Pb1)基底部刺穿对侧透明带，再在固定针下缘来回磨擦，直至卵细胞从切口针上逸出，并在ZP上可见一明显的缺口。第2步：去核。用平吸管(直径5～lO,~m)从切口处插入，连同Pbl及其下方的1／4～125胞质去掉。随着卵母细胞体内老化，其中期染色体逐渐偏离Pb1向卵中央移位，有的卵Pbl退化，而失去定位标志。这时则将卵母细胞放置于倒置显微镜下，在微分干涉系统(DIc)下用切口针不停地翻转卵母细胞，可见细胞核处折光性强，以其为定位，重复上述操作。

去核后的卵母细胞用0．25％的生理盐水低渗5rain，然后再用固定液(乙醇：球酷酸=3：1)固定lOmin，空气中自然干燥，然后染色，观寨去核结果。针的制备：拉针仪、锻针仪均由Narishige公司生产。固定针外径80～100tan．内径10tan。去核针外径10pro，内径6～8邮。用G一100型，规格lmm×0．9mm肉薄硝子管(Narishige公司生产)在拉针仪(PN一30型NarlshlgeJapan)["用参数(Heat75．1，mainMagic25．1，SubMagi77．1)制备出玻璃针，然后在针的直径约80tan处，切割玻璃针使其切口平整，再在锻针仪(MF一900Narish{geJapan)上烧口，使其外径80～100／~m，内径10／ma。并使针产生±40。角。拉针仪上用参数(Heat67．7lT~il"iMagic22．1SubMagic77．1)即可制备出外径1Om，内径6--8p．m的去核针，然后在锻针仪上打弯使其产生±40。角。

2结果
小鼠卵因其质膜极易破裂，较难操作，所以采用2步法去核。本组获卵总数I756个，zPD后存活卵数1731个，存活率98．6％，去核后存活卵数l246个，存活率710％。l246个存活卵中，染色后未见核卵数1070个，去核率85．9％，总去核率61％。
Wulmit[z1997年用6岁绵羊的乳房细胞作供核，成功地克隆出Dolly，从而把哺乳动物核移植带人一个全新的时代短短几年，世界各国竞相开展体细胞核移植。先后在小鼠、牛l4’等动物上获得成功，但核移植的成功率极低，小鼠仅为2％～3％，J。其原因之一就是不能高效地去除受体细胞中的染色体。去核操作是核移植过程中的重要技术，其最理想的方法是对任何发育时间的受体细胞都能有效地去除基因组物质而对非基因组组成成分不产生或仅产生极轻微的伤害哺乳动物卵母细胞去核的最大障碍是在对其遗传物质的去除或破坏过程中当即就怍出适当的判断，除兔卵能在去核针内见到中期板外，其它哺乳动物绝大多数在一般光学显微镜下都不能对中Ⅱ期卵母细胞中的染色体去除作出有效的观察．所以，核的定位显得相当重要。作者对卵母细胞进行去核手术时，对于剧排出的卵，以Pbl(Polatx~dy，Pb1)为定位标志．当核与Phl发生偏离时则在微分干涉差(DifferittatInterferenceContrastDic)倒置显微镜下用切口针不停地翻转卵母细胞观察，可见细胞核处折光性有差异，以此为定位。有作者认为，2．5％～3％蔗糖的浓度能提高其折光性，并使核向卵周踩突出。笔者曾作过一些尝试，未发现其明显优势。

据文献报道．最常用的去核方法是活性荧光染料染色定位，去核准确可靠．最高可达99．3％。但有一些作者报道这种操作对重构卵子的发育有影响。小鼠的受体细胞在用Hoechst一33342染色¨去核时，当紫外辐射超过30s，由于卵胞质效应引起发育潜能下降，且其成本、代价均较高，技术要求极为熟练，为笔者所弃。通过对1756枚卵母细胞进行去核手术，体会到核仁粘性较大，且周围有核膜包裹，呈团块样，故只要定位准确，就能将细胞核完整拖出，不带或只带出少量胞质。当去核针吸住核时由于核的直径比玻璃针的口径大，常粘堵于针口借助于一定的吸力，即可将核吸出。但核的定位往往较困难，稍许偏差，即会吸人较多的胞质，有时还会使细胞发生崩解。这也是本作者在手术过程中去核后卵存活数(1246枚，存活率为71．0％)不高的原因之一。

当使用盲吸法在手术时如何确定核是否被去净，可以通过去核后尽快将核从去核针内排出，一方面可防止核堵塞针管另一方面也可通过排出物质性状来判断所去除的是否为细胞核。如排出的物质为丝线状或团块状且不易分散，则为细胞核，如排出的物质呈颗粒状且很快分散，则为细胞质，则可重新定位去核。如在击核过程中将核破坏，只吸出少量的核，拨针时会见到针口有丝状物与细胞内连接，这时只需在同一部位再用一定的吸力，即可将核完整吸出，用力过猛，则细胞崩解。拨针后如看到细胞质颗粒一同流出，这个卵可能要溶解。作者将去核后存活的卵数进行固定、染色后观察核去除的结果，发现有1070枚卵内无核，去核率为85．9％。说明用此法去核有一定的可靠性。但显微操作是一种技术精度要求极高的操作，从总卵数来看，去核率
仅为61．0％。技术熟练度尚需提高。

针的制备是去核技术的基础，尤其是去核针的制备：在实验过程中曾尝试许多种参数制备许多种管径的去核针，但都因管径不符合要求，而使实验失败，只有当去核针的管径外径／内径7～10／5～8tan，才使实验得以继续。管径过太，往往吸力不易控制，吸人过多过少的胞质．而使细胞崩解。管径过小，则吸力过小不足以将核吸出。综上所述，去核技术是核移植过程中的一个重要步骤，针的制备是其成功的必备条件．细胞核的定位是成功的关键。
1983年McGrath和Soher在小鼠核移植中创立此法。先用细胞松弛素B(CytochalasinB)等细胞骨架抑制剂处理卵母细胞。然后用固定管在第一极体对面吸住卵母细胞，将去核针刺穿第一极体附近的透明带，吸出第一极体及其附近的适量胞质(1／4—1／3为宜)，即完成去核。该法的不足在于造成胞质流失和一些重要因子的丢失，从而影响到核的重编程和重构胚的后续发育，此外还给卵母细胞带来机械损伤。1986年Willadsen在绵羊核移植中将此法发展为透明带切开法，即两步去核法，试图减少去核过程中去核针对卵母细胞的机械损伤和提高去核率；后来，两步去核法又被改进为两步挤压去核法，但以上两种方法均操作繁琐、耗时长，难以达到满意的效果。

小鼠核移植最早采用盲吸去核法，但因小鼠卵母细胞抗机械损伤能力差，去核后卵母细胞成话率低，目前已被“火奴鲁鲁法”(Wakayamaetal，1998)取代，该法借助Piezo系统，去核率高达99％且成活率也达95％，这种方法对那些抗损伤能力差的动物卵母细胞不失为一种有效的替代盲吸法的机械去核法，但该法设备昂贵，不利于推广…；2005年。白照岱等借助透明带膨胀(ZPD)盲吸去小鼠卵细胞核，有效的降低了对卵母细胞的机械刺激，同时减少了操作时间和提高了卵母细胞去核后的成活率，该法对透明带薄又缺少弹性的卵母细胞较适用，对其它类型卵母细胞是否适用还有待研究。

通常，盲吸法去核的时间选择在第一极体刚排出时，因随时间延长卵细胞核远离第一极体，影响去核效率。严兴荣等(2005)报道注射hCGlOh后去小鼠卵核，去核率达90％以上；而12h后去核，去核率下降为22％。不同动物的最佳去核时间不同，牛卵母细胞一般为体外成熟18—20h后，而猪卵母细胞则在体外成熟44—48h后为宜。此外，不同动物卵母细胞的结构特点不同，其盲吸法的去核效率也不同。崔奎青等(2005)利用兔卵母细胞透明可在相差显微镜下观察到染色体的特点，将盲吸法与sping-dieview系统结合，去核率达98．4％且损失的胞质少”；而牛和绵羊等动物卵母细胞质中存在大量脂滴。中期染色体在显微镜下无法看见，其去核率平均仅为65％(Pratheretal，1987)，后来，Tsunoda用Hoechst33342等核特异性荧光染料显示染色体的位置来引导牛羊等卵子的盲吸去核，
显著提高了去核效率，但此法需用紫外线照射来显示卵细胞核，时间(一般15s以内)过长会损害卵细胞，所以现在
一般只用来检验去核效果；2001年，王敏康等发现3％的蔗糖溶液能很好的显示小鼠MⅡ期卵核的位置，显微镜
下能100％去核，去除的胞质体积仅为整个卵母细胞体积的1／8—1／12，而且以此去核卵为受体的重构胚发育良好这为牛羊等非透明的卵母细胞盲吸去核提供了新途径；不过，美国在极性光学显微镜的基础上研制出了一种纺锤体图像观察系统(spingdleview)，在这种显微镜下，可直接观察到牛等卵母细胞的纺锤体，从而可准确地去核，这种去核方法已逐渐被许多实验室采用。最后，卵母细胞在清洗和去掉周围卵丘细胞的过程中，部分卵母细胞的第一极体发生移位，也会影响去核效率(Konoetal，1991)，这在小鼠尤为明显。当然，操作者的熟练程度也是影响盲吸去核效率不容忽视的因素。盲吸去核法虽然存在这样一些不足，但其操作简捷、迅速，仍是目前哺乳动物克隆普遍采用的方法。
其机理是在极体排出阶段，采用干扰染色体分离或纺锤体功能的化学试剂，使所有染色体与纺锤体牢固结合同时蛋白合成抑制剂抑制细胞周期蛋白B合成，降低促成熟因子浓度，极体借助于惯性将染色质和纺锤体带出胞外，达到去核的目的。1993年Fulka等第一次尝试了此法，他们用鬼臼乙苷(Etoposkle，ETO)和放线菌酮(cycloheximide，CHXM)处理MI小鼠卵母细胞，去核率达96％…。可是Elsheikh等(1998)把ETO和CHXM诱导去核的卵做受体，与2一细胞期的小鼠卵裂球融合后得到的重构胚发育受到抑制。直到2000年，Aguisi等用脱羰秋水仙碱(demecolcine，DC，一种微管抑制剂)诱导激活的小鼠MⅡ卵母细胞去核，获健康克隆小鼠，这种去核法才引起各国研究人员广泛关注。随后，该法先后被用于兔、山羊、牛和小鼠的卵母细胞去核研究，并有克隆小鼠和兔克隆胎儿的产生。以上实验的成功，说明化学诱导卵母细胞去核避免了盲吸去核等机械方法带来的物理损伤和胞质大量损失，而且通过该法获得的去核卵母细胞具有支持基因重编程和胚胎发育到期的能力。

许多研究发现，卵母细胞的遗传背景对去核成功率有很大影响。牛的去核率为91％(Ficsher，2003)，猪则较低，为39．4％(Savardetal，2004)；Ibanez等(2003)比较了B6D2F1和CF1两种品系小鼠的去核率(6．9％和21％)，两者存在明显差异；2003年，Gasparrini对B6CBF1和B6D2F1小鼠进行了类似的研究，虽然它们的
去核率无明显差别，但在随后的重构胚发育能力方面表现出明显的品系依赖性。DC是目前最常用的化学诱导去核剂，其对激活卵母细胞的处理时间是影响去核率的重要因素。Baguisi等的研究发现，小鼠卵母细胞激活后15min，放入含DC培养液中处理，去核率可达54％；而此后的报道却认为小鼠卵母细胞激活后迅速用DC处理，效果更好。牛卵母细胞在激活30min和12h后分别进行DC处理，去核率从16％提高到91％。因此不同种属的卵母细胞进行DC处理时，采取的时间间隔有所不同，这很可能与他们的细胞周期进程不同步有关。一般来说，DC处理应在激活卵母细胞由第二次减数分裂后期向末期过渡进行”。此外Dc处理时的长短和卵母细胞的敏感性也是影响去核率不容忽视的因素(Baguisi，2003)。

与盲吸法等建立在显微操作系统基础之上的机械去核法相比，化学去核法程序简单、机械损伤小、胞质丢失少、重复性好、适合大规模卵母细胞去核，具有很乐观的应用前景。用该法去核的卵母细胞为受体已获得克隆鼠，而
在其它动物，化学去核只作为辅助手段来制备克隆动物此外将化学去核和无透明带技术相结合，使核移植可完全
脱离显微操作系统，目前已发展成为手工克隆(handmadecloning，HMC)。2004年Tecirliogu等采用HMC获得了体细胞克隆牛，它的成功大大简化了核移植程序，提高了核移植效率，加快其产业化步伐。
此法由Willadsen(1986)在绵羊上创立。先用固定管在第一极体对策固定卵母细胞，再用玻璃针在极体上部做一切口，然后用平口去核管沿切口插入，吸出第一极体及附近胞质，吸出量为总量1／2，用不含极体的一半进行核移植。虽然这种方法可以保证100％的去核率，但由于胞质减半，严重影响到胚胎发育。1998年，Peura在半卵法
的基础上又发展了一种切割去核法，该法将两枚去透明带的半卵合二为一，使受体细胞质恢复到去核前的水平，有效的改善了核的重编程和重构胚的发育，同时还简化了显微操作技术要求高盼受体卵母细胞去核和注核过程2001年和2003年，丹麦学者Booth和中国学者谭景和成功地将切割去核法应用于牛体细胞核移植和猪体细胞核移植，显示了该法良好的应用前景。
以往卵母细胞去核均在减数分裂的MⅡ期进行，而Bordignon(1998)却在牛卵母细胞成熟30h后，用酒精激活，使其排出第二极体，然后去掉第二极体和附近的少量胞质，这就是末期去核法。李裕强(2004)比较了MⅡ期去核和末期去核这两种去核方法，结果发现末期去核无论是去核率还是胚胎发育率均高于MⅡ期去核(P<0．01)。此外，末期去核还有时间同期化、去除胞质少、有利于重构胚发育、而且选择的是活化卵子，可筛选掉质量不高的卵子等优点。

除上述去核方法外，还有功能性去核法、离心去核法、荧光引导去核法、微分干涉和极性显微镜去核法。这些方
法中，有些方法是以上去核方法的有效补充，如荧光引导去核法、微分干涉和极性显微镜去核法；有些方法因弊端明显或操作繁琐现已很少使用，除非特殊情况，如功能性去核法、离心去核法。

二甲基亚砜	CB液	胞核
PBS	胞膜	胞浆