光学显微镜

光学显微镜是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器。

显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution）有关，分辨力是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm处）能分辨物体最小间隔的能力，分辨力的大小决定于光的波长和镜口率以及介质的折射率，用公式表示为：

R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsinα/2

式中：n=介质折射率；α=镜口角（标本对物镜镜口的张角），N.A.=镜口率（numeric aperture）。镜口角总是要小于180?，所以sina/2的最大值必然小于1。

显微镜是一种精密的光学仪器，已有300多年的发展史。自从有了显微镜，人们看到了过去看不到的许多微小生物和构成生物的基本单元——细胞。目前，不仅有能放大千余倍的光学显微镜，而且有放大几十万倍的电子显微镜，使我们对生物体的生命活动规律有了更进一步的认识。在普通中学生物教学大纲中规定的实验中，大部分要通过显微镜来完成，因此，显微镜性能的好坏是做好观察实验的关键。

早在公元前一世纪，人们就已发现通过球形透明物体去观察微小物体时，可以使其放大成像。

后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了认识。

1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。1610年前后，意大利的伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时，改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构，当时的光学工匠遂纷纷从事显微镜的制造、推广和改进。

17世纪中叶，英国的胡克和荷兰的列文胡克，都对显微镜的发展作出了卓越的贡献。1665年前后，胡克在显微镜中加入粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台。这些部件经过不断改进，成为现代显微镜的基本组成部分。

1673～1677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜，其中九台保存至今。胡克和列文胡克利用自制的显微镜，在动、植物机体微观结构的研究方面取得了杰出的成就。

19世纪，高质量消色差浸液物镜的出现，使显微镜观察微细结构的能力大为提高。1827年阿米奇第一个采用了浸液物镜。19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。这些都促进了显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，并为19世纪后半叶包括科赫、巴斯德等在内的生物学家和医学家发现细菌和微生物提供了有力的工具。

在显微镜本身结构发展的同时，显微观察技术也在不断创新：1850年出现了偏光显微术；1893年出现了干涉显微术；1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术，他为此在1953年获得了诺贝尔物理学奖。

古典的光学显微镜只是光学元件和精密机械元件的组合，它以人眼作为接收器来观察

放大的像。后来在显微镜中加入了摄影装置，以感光胶片作为可以记录和存储的接收器。现代又普遍采用光电元件、电视摄象管和电荷耦合器等作为显微镜的接收器，配以微型电子计算机后构成完整的图象信息采集和处理系统。

表面为曲面的玻璃或其他透明材料制成的光学透镜可以使物体放大成像，光学显微镜就是利用这一原理把微小物体放大到人眼足以观察的尺寸。近代的光学显微镜通常采用两级放大，分别由物镜和目镜完成。被观察物体位于物镜的前方，被物镜作第一级放大后成一倒立的实象，然后此实像再被目镜作第二级放大，成一虚象，人眼看到的就是虚像。而显微镜的总放大倍率就是物镜放大倍率和目镜放大倍率的乘积。放大倍率是指直线尺寸的放大比，而不是面积比。

光学显微镜一般由载物台、聚光照明系统、物镜，目镜和调焦机构组成。载物台用于承放被观察的物体。利用调

焦旋钮可以驱动调焦机构，使载物台作粗调和微调的升降运动，使被观察物体调焦清晰成象。它的上层可以在水平面内沿作精密移动和转动，一般都把被观察的部位调放到视场中心。

聚光照明系统由灯源和聚光镜构成，聚光镜的功能是使更多的光能集中到被观察的部位。照明灯的光谱特性必须与显微镜的接收器的工作波段相适应。

物镜位于被观察物体附近，是实现第一级放大的镜头。在物镜转换器上同时装着几个不同放大倍率的物镜，转动转换器就可让不同倍率的物镜进入工作光路，物镜的放大倍率通常为5～100倍。

物镜是显微镜中对成象质量优劣起决定性作用的光学元件。常用的有能对两种颜色的光线校正色差的消色差物镜；质量更高的还有能对三种色光校正色差的复消色差物镜；能保证物镜的整个像面为平面，以提高视场边缘成像质量的平像场物镜。高倍物镜中多采用浸液物镜，即在物镜的下表面和标本片的上表面之间填充折射率为1.5左右的液体，它能显著的提高显微观察的分辨率。

目镜是位于人眼附近实现第二级放大的镜头，镜放大倍率通常为5～20倍。按照所能看到的视场大小，目镜可分为视场较小的普通目镜，和视场较大的大视场目镜(或称广角目镜)两类。

载物台和物镜两者必须能沿物镜光轴方向作相对运动以实现调焦，获得清晰的图像。用高倍物镜工作时，容许的调焦范围往往小于微米，所以显微镜必须具备极为精密的微动调焦机构。

显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率，显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距。分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。

当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。

聚光照明系统是对显微镜成像性能有较大影响，但又是易于被使用者忽视的环节。它的功能是提供亮度足够且均匀的物面照明。聚光镜发来的光束应能保证充满物镜孔径角，否则就不能充分利用物镜所能达到的最高分辨率。为此目的，在聚光镜中设有类似照相物镜中的，可以调节开孔大小的可变孔径光阑，用来调节照明光束孔径，以与物镜孔径角匹配。

改变照明方式，可以获得亮背景上的暗物点(称亮视场照明)或暗背景上的亮物点(称暗视场照明)等不同的观察方式，以便在不同情况下更好地发现和观察微细结构。

光学显微镜有多种分类方法：按使用目镜的数目可分为双目和单目显微镜；按图像是否有立体

感可分为立体视觉和非立体视觉显微镜；按观察对像可分为生物和金相显微镜等；按光学原理可分为偏光，相衬和微差干涉对比显微镜等；按光源类型可分为普通光、荧光、红外光和激光显微镜等；按接收器类型可分为目视、摄影和电视显微镜等。常用的显微镜有双目体视显微镜、金相显微镜、偏光显微镜、紫外荧光显微镜等。

双目体视显微镜是利用双通道光路，为左右两眼提供一个具有立体感的图像。它实质上是两个单镜筒显微镜并列放置，两个镜筒的光轴构成相当于人们用双目观察一个物体时所形成的视角，以此形成三维空间的立体视觉图像。双目体视显微镜在生物、医学领域广泛用于切片操作和显微外科手术；在工业中用于微小零件和集成电路的观测、装配、检查等工作。

金相显微镜是专门用于观察金属和矿物等不透明物体金相组织的显微镜。这些不透明物体无法在普通的透射光显微镜中观察，故金相和普通显微镜的主要差别在于前者以反射光，而后者以透射光照明。在金相显微镜中照明光束从物镜方向射到被观察物体表面，被物面反射后再返回物镜成像。这种反射照明方式也广泛用于集成电路硅片的检测工作。

紫外荧光显微镜是用紫外光激发荧光来进行观察的显微镜。某些标本在可见光中觉察不到结构细节，但经过染色处理，以紫外光照射时可因荧光作用而发射可见光，形成可见的图像。这类显微镜常用于生物学和医学中。

电视显微镜和电荷耦合器显微镜是以电视摄像靶或电荷耦合器作为接收元件的显微镜。在显微镜的实像面处装入电视摄像靶或电荷耦合器取代人眼作为接收器，通过这些光电器件把光学图像转换成电信号的图像，然后对之进行尺寸检测、颗粒计数等工作。这类显微镜的可以与计算机联用，这便于实现检测和信息处理的自动化，多应用于需要进行大量繁琐检测工作的场合。

扫描显微镜是成像光束能相对于物面作扫描运动的显微镜。在扫描显微镜中依靠缩小视场来保证物镜达到最高的分辨率，同时用光学或机械扫描的方法，使成像光束相对于物面在较大视场范围内进行扫描，并用信息处理技术来获得合成的大面积图像信息。这类显微镜适用于需要高分辨率的大视场图像的观测。粗准焦螺旋：大范围上下调动镜筒。

细准焦螺旋：小范围上下调动镜筒。

利用可见光（380～760纳米波长）照明，使微小物体放大成像的仪器。这种放大像可用肉眼观察、摄影或用光电管以及其他接受器进行探测。（见彩图）       

基本结构 　可分为简单和复式两种类型。简单显微镜即放大镜,由正透镜组成，放置于物体和肉眼之间,使微小物体放大成虚像。复式显微镜由两组透镜或透镜系统组成。第一组透镜（即物镜）形成物体的放大像，第二组透镜（即目镜）放大第一组透镜形成的像。典型的复式光学显微镜由支架、反光镜、聚光镜、载物台、镜筒、物镜、目镜、以及调节镜筒或载物台移动的机械装置组成 (图1)。

反光镜的作用是使光线通过反射面进入仪器；载物台下的聚光镜，可增强对样品的照明能力;物镜在镜筒中形成一个中间的实像;目镜则放大中间像，在接近样品平面处形成一个虚像（当用肉眼观察时），或在目镜上方的照相底片平面上形成一个实像。
　　

性能 　除了能放大物体外，还应具有良好的分辩力以及形成好的反差像。

分辨力 　

指能够分辨出两个相距最近的物点的能力。可由下式表示：
两物点的最小分辨距离＝K λ为成像光线的波长，n 为样品周围介质的折射率，α是进入物镜光锥的半角，k为常数-约在 0.61～1.0之间，n·sinα 为物镜的数值孔径（常用N.A.表示），用于测定物镜的分辨力。数值孔径越大，能够分辨出二物点之间的距离则越小，因而分辨力就越强。光学显微镜的最小分辨距离为 0.2微米，如果小于这个距离就不能分辨。

反差 　

表明样品各部分之间以及它们与背景之间光亮度的差别。在一般明视场显微镜中，样品各部分对光的吸收不同，这是造成反差的主要原因。此外，样品表面上的散射对形成反差也很重要。在适当的情况下，缩小聚光镜的孔径光阑虽会减小显微镜的分辨力，但增强了反差，反而会使图像更清晰可辨。许多特殊显微镜正是基于增强样品的反差设计的。

透镜的像差 　

除了分辨力的限制以外，透镜本身存在着一系列缺陷，影响显微镜成像的质量。这些缺陷名为像差，包括由于透镜边缘和中央部分的折射不同造成的球差；由于不同波长的光线折射率不同造成的色差以及场曲等。用组合透镜可以纠正一定程度的像差。 　

物镜 

其作用是形成第一级像。在物镜上一般都标出数值孔径、放大率、焦距长度和工作距离等有关数值。一般对物镜

的球差都进行了校正；对两种颜色（蓝和红）色差进行了校正的物镜称为消色差物镜,校正3种颜色（蓝、绿和红）色差的称为复消色差物镜,居于二者之间的称为半-复消色差物镜。平场物镜纠正了场曲,适用于显微摄影。浸液物镜(浸油、水或其他化合物)可以增加数值孔径,提高物镜的分辨力。荧光显微镜中常用40倍或 60倍数值孔径为 1.30的浸液物镜，以增强收集荧光的能力。通常的物镜适用于0.17毫米厚度的盖玻片，但实际上盖玻片的厚度变动于0.15～0.22毫米之间，易造成像差，因而有些物镜上装置了“校正环”用来补偿盖玻片厚度的变化。

目镜 　

用于放大物镜形成的中间像，也用于校正中间像中的残余像差。

目镜有 5～20倍的放大倍数。惠更斯目镜是最常用的一种目镜。补偿目镜是与复消色差物镜组合使用的，以补偿复消色差物镜的放大率色差。为了保持最小畸变的平面场，设计了投影或摄影目镜，用于显微投影或摄影。长出瞳目镜适用于戴眼镜者观看。广视场目镜可观察到较大的现场。

镜筒 　

分为单目、双目、三目 3种。三目镜筒的两个目镜用于观察，另一个用于显微摄影、投影或测量。

聚光镜和照明 　

聚光镜用于集中从光源来的光线，使被观察的标本得到更明亮和均匀的照明。常用的有阿贝聚光镜,由两个透镜组成,数值孔径为1.30，通常带有球差和色差。多透镜的聚光镜可校正这些误差，其数值孔径可达1.40。正确使用聚光镜系统对于发挥显微镜的分辨力和增强像的反差有很大的影响。常用的照明系统有两种,一为临界照明,使光源聚焦在样品平面上；另一种为柯勒照明，即通过灯室透镜在聚光镜孔径光阑上形成光源的像，此外在标本平面上形成视场光阑的像。柯勒照相能得到均匀的照明，并得到好的反差像。照明可用日光或人工光。

暗视场显微镜 　

使用特殊的暗视场聚光镜使照明光线偏移而不进入物镜，只有样品的散射光进入物镜。因而在暗背景上得到亮的像（图2c），与暗视场照明相反，照明的光线直接到达成像平面的，称明视场照明。

暗视场显微镜主要用于观察结构和折射率变化有关的物体，如硅藻、放射虫类、细菌等具有规律结构的单细胞生物以及细胞中的线状结构，如鞭毛、纤维等。用暗视场显微镜还可观察到物镜分辨极限以下的质点，但不适用于观察染色的标本。

相差显微镜 　

利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别，把通过物体不同部分的光程差转变为振幅（光强度）的差别（图2b），经过带有环状光阑的聚光镜和带有相位片的相差物镜实现观测的显微镜。主要用于观察活细胞或不染色的组织切片，有时也可用于观察缺少反差的染色样品。

干涉显微镜 　

采用通过样品内和样品外的相干光束产生干涉的方法，把相位差(或光程差)转换为振幅（光强度）变化的显微镜，根据干涉图形可分辨出样品中的结构（图2f），并可测定样品中一定区域内的相位差或光程差。由于分开光束的方法不同，有不同类型的干涉显微镜，以及用于测定非均匀样品的积分显微镜干涉仪。

干涉显微镜主要用于测定活的或未固定的相互分散的细胞或组织的厚度或折射率。

微分干涉差显微镜 　

一种特殊形式的干涉显微镜，只是其相干光束分开的距离相当小,仅为1微米，有时还小于物镜的最小分辨距离，因而二束相干光都通过样品，可观察到样品中光程差的局部差异（梯度）。

微分干涉差显微镜用于观察活的或未染色的样品的精细结构，产生一种带颜色的如浮雕般的反差像（图2d）但不能用于定量测定。

荧光显微镜 　

用激发光照射样品，根据样品产生的荧光进行观察的显微镜（图2e）。生物学、医学中应用的荧光有自发荧光、

诱发荧光（包括酶或化学诱发）、荧光着色、免疫荧光等。荧光显微镜激发光照射的方式，有透射和落射两种

偏光显微镜 　

用于观察双折射样品的显微镜。绝大多数结构有规则的生物体系的折射率因光波传播方向而异，一般称为双折射体系，有分子（晶体）双折射、形式双折射、应力双折射或几种类型兼而有之。偏光显微镜的主要组成是在一般显微镜的光源和聚光镜之间放置一个起偏(振)镜，在物镜和目镜之间放置一个检偏(振)镜，并采用旋转载物台。调节起、检偏振镜的主截面使之互相垂直（正交位置），使在暗背景上显出双折射样品的明亮像。此外，利用各种补色器可以定量测定双折射的程度，进而推算出分子或颗粒在样品中排列的方向。近有用远红外线作光源的显微镜，由于波长不受水的干扰，反差也好，不用染色即可观察活体。另外，还有利用紫外线做光源的显微镜，它用反射光学或特殊的晶体透镜系统。

显微镜可根据不同用途对各种结构作适当的改变，形成许多其他类型。如比较显微镜、倒置显微镜、解剖体视显微镜、毛细管显微镜以及离心显微镜等。

近年来在光学显微术的重大进展是共焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microcope,CLSM)的应用，它大大的提高了影像的反差和分辨力。由于只使物镜焦面上的样品成像,所以可对样品进行“光切片”,并通过计算机样品影像进行三维重组。
　　

谷祝平:《光学显微镜》,甘肃人民出版社,兰州,1985。

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