体细胞杂交

体细胞是生物体除生殖细胞外的所有细胞。将从身体分离的体细胞做组织培养进行遗传学研究的学科称为体细胞遗传学（somaticgenetics）。体外培养细胞可人为控制或改变环境条件，并可建立细胞株，长期保存，进行各种正常和病理研究。与基因定位有关的是体细胞杂交（somaticcellhybridization）。细胞杂交又称细胞融合（cellfusion），是将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞。大多数体细胞杂交是用人的细胞与小鼠、大鼠或仓鼠的体细胞（hybridcell）进行杂交。

细胞融合后，要进行异核体的筛选。所用方法是：①根据双亲细胞的形态特征，用不同荧光染料标记，人工挑选或用荧光激活细胞分拣机分离。或通过显微操作直接挑选。②在合适的选择压下，只允许杂种细胞生长，淘汰双亲和同源融合细胞。如生长激素自主选择、代谢互补选择、白化互补选择、营养缺陷型互补选择、药物抗性互补选择等。

融合后的杂种细胞的异核体，多数情况下在第一次有丝分裂期即发生两个亲本核的融合，如果两个核在杂种细胞中位置较近，也可能在有丝分裂前就发生融合。如果两个核不融合，有可能发育成嵌合体。如果两核既相互辅助又相互排斥，从而导致染色体丢失，经常还会伴随着染色体重排、染色体碎片、染色体环、染色体桥等形成。融合后的两个原生质体的细胞质，可能均匀混合，细胞器也均匀分布，因此双方的叶绿体及线粒体基因都得到遗传。也有人认为在两个原生质体融合时，质体会随机丢失。融合后的细胞是否为杂种，多用染色体形态比较法和同工酶分析法来鉴定，也有用花器官的形态颜色来检测的。

一般来说，植物有性杂交只能在同种或在系统分类上相近种的亲本间进行，核性状按孟德尔遗传规律分离，而核外基因则大多数为母性遗传。体细胞杂交能克服有性杂交的配子不亲合性，获得一些含有另一亲本非整倍体的杂种或胞质杂种。它们的遗传变异范围极广，大大丰富了育种的原始材料，从而创造出自然界中没有的新物种。如马铃薯与番茄融合得到的薯番茄和番茄薯。没有壁的裸露细胞，有利遗传操作，转移部分基因或基因组，已成功的如胡萝卜一S欧芹融合。因此体细胞杂交在物种改良上有着广阔前景。另外甘蓝与白菜融合，人工合成的甘蓝型欧洲油菜，在实验室中短时间内重复出现了自然界的进化过程，使芸苔属的三角进化关系又一次得到验证。体细胞杂交技术也为细胞生物学研究及遗传学分析提供了一个新的研究途径。
新产生的融合细胞称为杂种细胞（hybridcell)，含有双亲不同的染色体。杂种细胞有一个重要的特点是在其繁殖传代过程中出现保留啮齿类一方染色体而人类染色体则逐渐丢失，最后只剩一条或几条，其原因至今不明。这种仅保留少数甚至一条人染色体的杂种细胞正是进行基因连锁分析和基因定位的有用材料。由于人和鼠类细胞都有各自不同的生化和免疫学特征，Miller等运用体细胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。但凡含有人第17号染色体的杂种细胞都因有TK活性而存活，反之则死亡。从而推断TK基因定位于第17号染色体上。这是首例用细胞杂交法进行的基因定位。由此可见，研究基因定位时，由于有杂种细胞这一工具，只需要集中精力于某一条染色体上，就可找到某一基因座位。

辐射性杂交(radiationhybridRH)制图技术是1975年由Goss和Harris创立的一种体细胞杂交技术，适用于构建人类基因组长范围内的高分辨率连续物理图谱。成熟的辐射性杂交制图技术是由CoxVR等人于1990年建立的。
1．原理
利用高剂量的X射线将候选染色体打断成若干片段，含有这种片段的细胞可与仓鼠细胞形成杂交克隆。在这种杂交中，人类染色体片段被插入到仓鼠染色体的中间部分，因此大部分克隆片段在进行有丝分裂时处于稳定的状态。利用类似于遗传重组原理和最大似然性的统计学方法来计算存在于DNA片段上的多态性或非多态性标记之间的断点频率，以此估计标记之间的距离，并建立人类基因组拷贝库---体细胞杂交系统。可根据不同要求构建出断裂程度不同的多套拷贝，从而得到不同分辨率的放射杂交图。总之，辐射性杂交是建立在受到X射线照射的供体细胞与非放射线处理的受体细胞融合基础上的一种体细胞遗传学方法，是利用两个标记之间被X射线打断的概率来计算标记之间距离，通过类似于减数分裂连锁制图的方法来确定标记之间的顺序。

2．试验流程
G3嵌板的产生→确定STSs→PCR体系及反应条件→构建RH图谱.

3．特点
优点
荧光原位杂交(FISH)法和辐射杂种细胞系(RH)技术是国际上最常用的基因定位的两种方法，各有优缺点。FISH可以定位基因组中多个同源位点，结果直观、可靠，而RH法则很困难。但是FISH法检测步骤繁杂，尤其受探针大小的影响较大，2kb以下的cDNA序列很难定位，而且结果需要有经验的细胞遗传学家进行分析。RH法简单易行，定位精度高，适合小于lkb--2kb以下的序列，根据统计学方法可直接定位。其结果也便于不同实验室间比较。和其他作图法相比，RH作图法是依赖于辐射引起的断点而不是靠减数分裂重组得到的断点，是一种完全独立的方法，所以是一个互补的作图方法，可利用所有不同的STSs，具有巨大的DNA补充潜力，从而有利于整合不同的遗传和转录图以及所有基因组位标(无名序列、中心粒和端粒)。

缺点
但是RH法也受到某些自身条件的限制，RH嵌板中每个杂交克隆均包括仓鼠和人的基因组DNA，可以看作是在仓鼠基因组DNA背景下相区别。如有些基因无法定位的原因即在于它的序列包括阅读框架以及3，UTR区域与仓鼠的相似性高达90%以上。此外，做ESTs或全长cDNA定位的引物为cDNA序列，而RH法是在基因组DNA上扩增出相应的片断，由于内含子序列的存在，扩增结果与引物设计的部位直接有关，一般应选用3，UTR部位的序列。还应指出，用RH法能否成功定位，依赖于该基因所在染色体区域上合适位标的存在。如果现有的RH图中此区域分布的合适位标过少，可改用位标位点多的嵌板。因此随着今后RH图精度的提高，越来越多的STSs被放置于染色体上，有望弥补这个缺陷。

4．应用
辐射性杂交技术是继荧光原位杂交后新近建立的染色体定位方法，RH作图法提供了一种联系物理图和遗传图的方法，已成为当今构建人类基因组大尺度、高密度、连续的染色体图的常用方法之一。其用途主要有：EST定位、基因克隆、基因组作图、测定距离、寻找新基因等。

植物体细胞杂交是在原生质体培养技术的基础上，借用动物细胞融合方法发展起来的一门新型生物技术。植物体细胞杂交的过程包括原生质体的制备，原生质体融合的诱导，杂种细胞的筛选和培养，以及杂种植株的再生与鉴定等环节。下面以烟草和大豆的体细胞杂交为例，简要介绍植物体细胞杂交的过程。

原生质体制备选取烟草植株上的幼嫩叶片和培养好的大豆细胞，用酶解法制备原生质体。烟草的原生质体呈绿色，大豆的无色，在显微镜下很容易将二者区别开来。

原生质体融合取等量的烟草和大豆的原生质体混合后，加入聚乙二醇溶液。在显微镜下观察，可以看到原生质体相互黏集在一起。隔一段时间后，加入高钙、高pH的溶液，这时原生质体才开始融合。原生质体融合包括膜融合和核融合两个过程。诱导融合只能诱导细胞膜的融合，两个核的融合是在杂种细胞第一次有丝分裂时进行的。

杂种细胞的筛选和培养烟草与大豆的原生质体融合后，将原生质体转移到适当的培养基上培养，使原生质体再生出细胞壁。这时，在细胞混合物中，不仅有烟草—大豆杂种细胞，还有烟草细胞、大豆细胞、烟草—烟草细胞、大豆—大豆细胞。杂种细胞的筛选，可以用机械方法，也可以用生理学或遗传学的方法。以机械方法为例，根据两种亲本细胞在形态、色泽上的差异，将细胞分别接种在带有小格的培养皿中，每个小格中约放1～3个细胞。在显微镜下找出杂种细胞，并且标定位置。等杂种细胞分裂成细胞团时，转移到培养皿中，培养成愈伤组织。

杂种植株的再生与鉴定杂种植株的再生是指从愈伤组织培养出杂种植株的过程。由于烟草和大豆分别属于茄科和豆科，二者的原生质体融合后，至今只能长成杂种愈伤组织，还不能分化，因此谈不上杂种植株的再生和鉴定。对于能够再生出杂种植株的，如烟草—海岛烟草、白菜—甘蓝、胡萝卜—羊角芹等，长出的植株究竟是不是杂种，还需要经过鉴定才能确定下来。杂种植株的鉴定方法有形态学方法、生化方法(如电泳)、细胞学方法(如染色体组型分析)、分子生物学方法(如分子杂交)等

一.实验目的
了解用聚乙二醇PEG方法诱异同种植物原生质体融合的技术，并能根据新本原生质体的形态樗来鉴别杂种细胞。

二.实验原理
不同种植物的原生质体可在人工诱导条件下融合，所产生的杂种细胞，即异核体经过培养可再生新壁，分裂形成愈伤组织，进而分化产生杂种植株。由于进行融合的原生质体来自体细胞，故该项技术也叫体细胞杂交。原生质体融合能使有性杂交不亲合的植物种间进行广泛的遗传重组，因而在农业育种上具有巨大的潜力。在植物遗传操作研究中也是关键技术之一。

人工诱导原生质体融合可使用物理学方法，如运用细胞融合仪，在电场诱因导下实现融合，然而至今广为使用的仍是聚乙二醇（PEG）溶液引起原生质体的聚集和粘连，然后用高pH钙溶液相处理的化学方法（Kao等，1974）。该法应用分子量至为1500~6000的聚乙二醇（PEG）溶液引起原生质体的聚集和粘连，然后用高pH的钙溶液稀释时，就产生了高频率的融合，融合的频率和省略常与所有PEG的分子量、浓度，作用时间，原生质体的生理状态与密度以及操作者的细心程度有关。

三、实验材料与仪器
1．实验材料：
烟草或其它植物无菌苗的叶片。
胡萝卜肉质根诱导的松软愈伤组织或悬浮培养细胞。
2．试剂
2.1酶液及洗涤液，同植物原生质体的分离和培养实验。
2.2PEG溶液
2.3高pH高钙稀释液
2.4DPD培养基同植物原生质体的分离和培养实验。

四、实验方法
所有操作均在超净工作台上进行。
1．原生质体的分离和收集。
2．将收集的两种不同材料的原生质体分别悬浮在0.16mol/L的CaCl2·2H2O（pH5.8~6.2）原生质体密度调整为2×105/ml左右（用血细胞计数板统计原生质体密度）。
3．将两种原生质体悬液等量混合。
4．用刻度吸管将混合的原生质体悬液滴在直径为60mm的平皿中，每皿滴7~8滴，每滴约0.1ml。然后静置10in，使原生质体巾在皿底上，形成一薄层。（应有3~5个平皿的重复）。
5．用吸管将等量的PEG溶液缓慢地加在原生质体液滴上，再静置10~15min。此时可取一个平皿在倒置显微镜上观察原生质体间的粘连。
6．用刻度吸管向原生质体液滴慢慢地加入高pH、商钙稀液。第一次加0.5ml，第2次1ml，第3、4次各2ml，每次之间间隔5min。
7.将平皿稍微倾斜，吸去上清液，再缓缓加入4ml稀释液。5min后，再倾斜平皿，吸去上清液注意吸去上清液时勿使原生质体漂浮起来。
8.用DPD培养基如上法换洗二次。
9.每平皿中加培养基2ml，轻轻摇动平皿。
10.用蜡膜密封平皿。置260下进行24h暗培养，然后转到弱光条件下培养。

实验结果
1．在倒置显微镜下观察异源融合。在培养3天以内，可根据双新原生质体的形态特征来鉴别异核体。因为来自叶肉组织的原生质体具有明显绿色叶绿粒，而来自培养细胞的原生质体无色，但具浓密原生质丝，并可看到显示的核区。
2．统计异源融合的频率

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