DNA连接反应

利用DNA连接酶把载体DNA和要克隆的目的DNA片段连接在一起，成为一个完整的重组分子，这就是分子克隆中常说的连接反应。当载体DNA和外源DNA末端都是由一种产生粘性末端的内切酶切割产生的话（同尾酶也可以），或者两者末端被接上一段互补的多聚体的尾巴，那么经退火后可形成新的重组分子。连接后产生的重组分子中仍然保留着外源DNA两端的限制性内切酶切点，从而使我们能方便地从重组分子再次取出所克隆的DNA段。

外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA５'磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和Ｔ４噬菌体DNA连接酶。实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端DNA片段连接起来。

DNA一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的DNA末端的浓度决定。不论末端位于同一DNA分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种DNA，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体DNA。在瓜作用的底物。如果反应中DNA浓度低，则配对的两个末端同一DNA分子的机会较大（因为DNA分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。这倦，在DNA浓度低时，质粒DNA重新环化将卓有成效。如果连接反应中DNA浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个DNA分子的末端碰到另一DNA分子末端的可能性也有所增大。因此在ＤＮＡ浓度高时，连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。Dugaiczyk等从理论上探讨了DNA浓度对连接产物性质的影响。简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：j和i。j是DNA分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，j的数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的DNA呈随机卷曲。这样，j与DNA分子的长度成反比（因为DNA越长，某一给定分子的两末端的越不可能相互作用），因此j对给定长度的DNA分子来说是一个常数，与DNA深度无关。j＝[3/(3πlb0)]3/2其中l是DNA长度，以cm计，b是随机卷曲的DNA区段的长度。b的值以缓冲液的离子强度为转移，而后者可影响DNA的刚度。

i是溶液中所有互补末端的深度的测量值，对于具有自身互补粘端的双链dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml这里Ｎo是阿佛伽德罗常数，Ｍ是DNA的摩尔浓度（单位：mol/L）。理论上，当j=i时，给定DNA分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。因而在这样的条件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。而当j>i时，有利于重新环化；当i>j，则有利于产生多联体。DNA区段的大小与连接反应混合物中j：i之比分别为0.5、1、2和5时所需ＤＮＡ浓度之间关系（Ｄugaiczyk等，1985）。现在考虑如下的连接反应混合物：其中除线状质粒之外，还含有带匹配末端的外源ＤＮＡ片段。对于一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组基因组的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响，而且还受质粒和外源ＤＮＡ末端的相对浓度的影响。当i是j的２－３倍（即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时）外源DNA末端浓度的２倍时，有效重组体的产量可达到最大。这些条什下，连接反应终产物的大约40％都是由单体质粒与外源DNA所形成的嵌合体。当连接混合物中线瘃质粒的量恒定（j:i=3）而带匹配末端的外源DNA的量递增时，这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。涉及带粘端的线状磷酸化质粒DNA的连接反应应包含：
１）足量的载体DNA，以满足j:i>1和j:i<3。对一个职pUC18一般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体DNA为20-60μg/ml。
２）未端浓度等于或稍高于载体DNA的外源DNA，如外源DNA浓度比载体低得多，在效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒DNA或发迹克隆策略以便通过定向克隆的方法构建重组质粒。

１）用适当的限制酶消化质粒和外源DNA。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒DNA。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化DNA，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。

２）按如下所述设立连接反应混合物：
a．将0.1μl载体ＤＮＡ转移到无菌微量离心管中，加等摩尔量的外源ＤＮＡ。
b．加水至7.5μl，于45℃加温５分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到０℃。
c．加入：
10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液１μl
Ｔ４噬菌体ＮＤＡ连接酶0.1Weiss单位
５mmol/LATP1μl于16℃
温育１－４小时
10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液
200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)
50mmol/KMgCl250mmol/L二硫苏糖醇
500μg/ml牛血清白蛋白（组分Ｖ.Sigma产品）（可用可不用）
该缓训液应分装成小份，贮存于－20℃。
另外，再设立两个对照反应，其中含有（１）只有质粒载体；（２）只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒ＤＮＡ，并尽可能多加外源DNA，同时保持连接反应体积不超过10μl。可用至少３种不同方法来测定Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶的活性。大多数制造厂商（除NewEnglandBiolabs公司外）现在都用Weiss等，１1968)对该酶进行标化。１个Weiss单位是指在37℃下20分钏内催化１mmol32P从焦磷酸根置换到[γ,β-32P]ATP所需酶时，１个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位（Modrich和Lehman,1970)或者60个粘端单位（如ＮewEnglandBiolabs公司所定义）。因此，0.015Ｗeiss单位的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶在16℃下30分钟内可使50％的λ噬菌体HindⅢ片段（5μg）得以连接。在本书中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶一律用Weiss单位表示。par目前提供的Ｔ４噬菌体DNA连接酶均为浓溶液（1-5单位/μl），可用20mmol/LTris.Cl(pH7.6)、60mmol/LKCl、5mmol/L二硫苏糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50％甘稀释成100单位/ml的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的Ｔ４噬体ＤＮＡ连接酶于-20℃保存３个月可保持稳定。
３）每个样品各取１－２μl转化大肠杆菌感受态细胞。

Ｔ４噬菌体DNA连接酶不同于大肠杆菌DNA连接酶，它可以催化平端DNA片段的连接（Sgaramella和Khorana，1972：Sgaramella和Ehrlich，1978），由于DNA很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何DNA分子彼此相连。然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下４个条件：１）低浓度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka，1981）。
２）不存在亚精胺一类的多胺。
３）极高浓度的连接酶（50Weiss单位．ml）。
４）高浓度的平端。

１．凝聚剂
在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanTＨarrison,1985)或氯化六氨全高钴（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得适当浓度的平端DNA的总是迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用：
１）它们可使平端ＤＮＡ的连接速率加大１－３个数量级，因此可使连接反应在酶DNA浓度不高的条件下进行。
２）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的DNA浓度下，所有的DNA产物也将是线状多聚体。par在设立含凝聚剂的连接反应时，下列资料可供参考。

（１）聚乙二醇（PEG8000）
１）用去离子水配制的ＰＥＧ8000贮存液（40％）分装成小份，冰冻保存，但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含15％PEG8000的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显著。除PEG800和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于０℃混合，然后加适当体积的PEG8000（处于室温），混匀，加酶后于20℃进行温育。
２）连接混合物中含0.5mmol/LATP和5mmol/LMgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至ATP浓度略有增加或ＭgCl2浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。
３）浓度为15％的PEG8000可刺激带粘端的DNA分子的连接效率提高至原来的10-100倍，反应的主产物是串联的多联体。
４）PEG8000可刺激短至８个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六氨合高钴有所不同。

（２）氯化六氨合高钴
１）氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20℃，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5μmol/L时，其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部，但只能使端连接的效率提高到原来的５倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。
２）在单价阳离子（30mmol/LKCl）存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变。连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状DNA将点尽优势。
３）与PEG8000不同，氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。

DNA片段的连接在基因操作过程中应用广泛。通常情况下利用T4DNALigase必须经过长达16小时才能完成连接反应,而且反应常常受到DNA末端结构等的影响。宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)的DNA连接系统(TaKaRaDNALigationKitVer.2)由于其独特的反应液体系,可以将反应时间缩短至半个小时,且不受DNA结构等的影响,大大地节省了反应时间,方便了实验操作。此外,在使用本试剂盒时,由于只需简单地向DNA溶液中加入一种溶液,可以在极小的反应体积下,短时间内高效地完成各种形式的DNA连接。并且反应液可以直接用于感受态细胞的转化和体外包装等。

1　试剂盒内容(50次量)
SolutionI(酶溶液)250μl×3;SolutionⅡ(缓冲液)750μl×1。

2　向pUC118-EcoRI分解物中插入DNA片段(环状DNA的连接)
含有pUC118/EcoRIFragment(50ng)及1.5KbpEcoRIFragment(2.5～250ngg)的DNA溶液共5μl，加入等量的SolutionI溶液(5μl)，混合均匀后在16℃下反应30分钟，取反应液的一部分转化至JM109感受态细胞后在含有X-Gal、IPTG及Amp的L-琼脂平板培养基上涂板生长，形成单菌落，计数白色菌落。同时以通常使用T4DNALigase(350U)，在16℃下进行16小时的连接反应作对照。在本实验中所使用的JM109感受态细胞的转化效率为6.3×107Colonies/μgpUC18DNA。结果表明,使用DNALigationKitVer.2时的连接效率比使用T4DNALigase时的连接效率高。

3　向噬菌体臂λgt11/EcoRI中插入pBR322/EcoRI分解物(线形DNA的连接)
含噬菌体臂λgt11/EcoRI(脱磷酸化)250ng及pBR322/EcoRI25ng的DNA溶液共5μl,加入与DNA等量的SolutionⅡ(5μl),均匀混合。然后加入DNA溶液2倍量的SolutionI(10μl)，在26℃下反应10分钟。取20μl反应液中的4μl,使用λDNAinVitroPackingKit进行体外包装,形成噬菌体粒子，并以此感染EcoliY1090(r-)形成透明噬菌斑。同时以T4DNALigase(350U),在26℃的连接反应作对照。结果同样表明,使用DNALigationKitVer.2时的连接效率比使用T4DNALigase时的连接效率高。

生物学	传代培养	RACE技术	心肌细胞
自然科学	细胞脱核技术	光学分析	原代培养

[1] 丁香通 http://tong.dxy.cn/article/9/10/69/5000_1.htm
[2] 生物在线http://show.bioon.com/protocol/smallclass.asp?sortid=&typeid=1705&newstype=dna%C1%AC%BD%D3
[3] 万方数据库 http://med.wanfangdata.com.cn/periodical/periodical.articles/yc/yc99/yc9902/990210.htm