SD序列
在起始密码子上游约4~7个核苷酸之前还有一段富含嘌吟的5′…AGGAGG…3′短小序列,它可以与16SrRNA3′端的3′…UCCUCC…5′区段完全互补。mRNA上的这段序列称为ShineDalgarno序列(简称SD序列)。
SD序列与16SrRNA序列互补的程度以及从起始密码子AUG到嘌呤片段的距离也都强烈地影响翻译起始的效率。不同基因的mRNA有不同的SD序列,它们与16SrRNA的结合能力也不同,从而控制着单位时间内翻译过程中起始复合物形成的数目,最终控制着翻译的速度。
(1)RNA一般以单链形式存在;(2)RNA中的核糖其C′-2不脱氧的;(3)尿苷(U)取代了DNA中的胸苷。细胞中的RNA分成三种:mRNA(信使RNA),tRNA(转运RNA)和rRNA(核糖体RNA)。它们的功能各不相同。mRNA是合成蛋白质的模板,tRNA是转运特异氨基酸的运载工具,rRNA是合成蛋白质的装置。mRNA的碱基序列,决定着蛋白质装配时氨基酸的序列。
1955年Brachet用洋葱根尖和变形虫进行了实验;若加入RNA酶降解细胞中的RNA,则蛋白质合成就停止,若再加入从酵母中提取的RNA,则又可以重新合成一些蛋白质,这就表明,蛋白质的合成是依赖于RNA。
同年Goldstein和Plaut用同位素标记变形虫(Amoebaproteus)RNA前体,发现标记的RNA都在核内,表明RNA是在核内合成的。在标记追踪(pulse-chase)实验中,用短脉冲标记RNA前体,然后将细胞核转移到未标记的变形虫中。经过一段时间发现被标记的RNA分子已在细胞质中,这就表明RNA在核中合成,然后转移到细胞质内,而蛋白质就在细胞质中合成,因此RNA就成为在DNA和蛋白质之间传递信息的信使的最佳候选者。
Brenner,s.Jacob,F.和Meselson(1961)进行了一系列的的实验,他们将E.coli培养在15N/13C的培养基中,因此合成的RNA和蛋白都被“重”同位素所标记。也就是说凡是“重”的核糖体,RNA和蛋白都是细菌的,然后用T2感染E.coli,细菌的RNA停止合成,而开始合成T2的RNA此时用普通的“轻”培养基(14N/12C),但分别以32P来标记新合成的T2RNA,以35S标记新合成的T2蛋白,因此任何重新合成的核糖体,RNA,及蛋白都是“轻”的但带但有放射性同位素。经培养一段时间后破碎细胞,加入过量的轻的核糖体作对照,进行密度梯度离心,结果“轻”的核糖体上不具有放射性,“重”的核糖体上具有32P和35S,表明(1)T2未合成核糖体,“轻”核糖体却是后加放的。(2)T2翻译时是借用了细菌原来合成的核糖体,所以核糖体并无特异性,核糖体上结合的mRNA,其序列的特异性才是指导合成蛋白质的遗传信息,从而提出了mRNA作为“信使”的证据。因此他们将这种能把遗传信息从DNA传递到蛋白质上的物质称为“信使”。他们预言(1)这种“信使”应是一个多核苷酸;(2)②其平均分子量不小于5?105(假定密码比是3),足以携带一个基因的遗传信息;(3)它们至少是暂时连在核糖体上;(4)其碱基组成反映了DNA的序列;(5)它们能高速更新。Volkin和Astrachan发现高速更新的RNA似乎完全符合以上条件。Jacob和Monod将它定名为信使RNA(MessengerRNA)或mRNA。
用自洽聚类方法判定大肠杆菌蛋白质编码基因SD序列强弱,给出构成强SD序列的17种碱基关联模式。将全部SD序列按作用强弱不同分为三类:强、中、弱,发现强弱不同时最偏好模式不同,如GGAGG是弱SD序列的最偏好模式,AAGGA是强SD序列的最偏好模式。同一模式距起始密码子的距离不同时,所起的调控作用也不同,如GGAG模式中的A在强SD序列中位于-8位点,在弱SD序列中位于-7和-9位点。平均来说,各SD序列的-9位点上碱基G出现的概率最大。结果还表明SD序列越强,基因的表达水平越高,SD序列越弱,基因表达水平越低。SD序列与anti-SD序列的配对程度和相对位置影响起始密码子的识别和翻译效率。
原核基因转录和翻译几乎在胞质中同时发生,在mRNA5’端起始密码子AUG上游-3~-11处,为核蛋白体rRNA的结合位点(3-9bp)因由Shine-Delgarno发现,又称SD序列。此序列富含A-G,恰与16SRNA3’端富含T-C的序列互补,因此mRNA与核蛋白体sRNA容易配对结合。因此SD序列对mRNA的翻译起重要作用。
启动子下游从转录起始位点开始延伸的一段碱基序列,其中能与rRNA16S亚基3'端互补的SD序列对形成翻译起始复合物是必需的,多数载体启动子下游都有SD序列,也有些载体没有,适合自带SD序列的基因表达。
核糖体不在一个mRNA的末端启动转录过程,相反,它们会结合到一个内部点(Shine-Dalgarno(SD)序列)上,然后单向转位。对断开核糖体的mRNA和30S部分之间的结合所需的力进行的精确测量显示,在第一个肽链形成之前,SD序列稳定核糖体-mRNA的相互作用。一旦该肽链形成,SD序列就不再稳定它。所以,最初肽链的形成是核糖体释放SD的一个触发因素,而且还可能是允许核糖体开始沿mRNA运动的一个重要因素。
Ⅰ类:这类反义RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列和/或编码区,引起翻译的直接抑制(ⅠA类)或与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNA酶Ⅲ的敏感性增加,使其降解(ⅠB类)。Ⅱ类:这类反义RNA与mRNA的SD序列的上游非编码区结合,从而抑制靶mRNA的翻译功能。其作用机制尚不完全清楚,可能是反义RNA与靶mRNA的上游序列结合后会引起核糖体结合位点区域的二级结构发生改变,因而阻止了核糖体的结合。Ⅲ类:这类反义RNA可直接抑制靶mRNA的转录。
ticRNA(transcriptioninhibitorycomplementaryRNA)是大肠杆菌中CAP蛋白(cAMP结合蛋白)的mRNA的反义RNA。ticRNA的基因的启动子可被cAMP-CAP复合物所激活,从CAPmRNA的转录起始位点上游3个核苷酸处开始,以CAPmRNA的模板DNA链的互补链为模板,合成ticRNA。ticRNA具体长度不清楚,但是它是5'端一段正好和CAPmRNA的5'端有不完全的互补,可以形成双链的RNA杂交体。而在CAPmRNA上紧随杂交区之后的是一段约长11bp的A,U丰富区。这样的结构十分类似于ρ不依赖性的转录终止子的结构,从而CAPmRNA的转录刚刚开始不久后即迅速终止。CAP蛋白合成的自我调节作用。当CAP合成达一定量后,即可与cAMP结合成cAMP-CAP复合物。再激活ticRNA的启动子转录出ticRNA,反过来抑制CAP-mRNA的合成。
设计反义RNA基因是时应注意之点总结如下:
1、长的反义RNA并不一定比短的反义RNA更为有效。
2、在原核生物中针对SD序列及其附近区域的反义RNA可能更有效。
3、在真核生物中,对应于5'端非编码区的反义RNA可能比针对编码区的反义RNA更有效。
4、尽量避免在反义RNA分子中出现自我互补的二级结构。
5、设计的反义RNA分子中不应有AUG或开放读框,否则该反义RNA亦会与核糖体结合而影响其与靶mRNA的配对结合。
6、进一步还可以将带有ribozyme结构的RNA连在反义RNA的3'端尾上,当反义RNA与靶mRNA杂交后,即可利用其酶活性来降解靶mRNA。
此外,为了增强反义RNA的作用,还可以采取一些额外措施,例如:
1、由于反义RNA对靶mRNA的抑制作用有剂量依赖性,所以在构建反义RNA基因时,要选择强的、可以诱导的启动子以增强反义RNA本身的表达。
2、构建许多个反义RNA基因串连在一起,以得到线性重复的多拷贝基因,对提高反义RNA的表达也有利。
3、RNA酶Ⅲ可以降解RNA:RNA杂交体,所以在构建反义RNA基因时,可将RNA酶Ⅲ的基因也同时转化到靶细胞中并进行表达。这样,当反义RNA与靶mRNA结合后,RNA酶Ⅲ即可将其降解。这显然有利于反义RNA的抑制作用。
有关反义RNA的研究进展迅速,已经应用到抗病毒感染,研究癌基因的作用机制,探索肿瘤治疗的可行途径等方面。在今后一段时间内,有关反义RNA的研究肯定将会有更加迅速的进展和更广阔的应用前景。
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