DNA连接反应

利用DNA连接酶把载体DNA和要克隆的目的DNA片段连接在一起，成为一个完整的重组分子，这就是分子克隆中常说的连接反应。当载体DNA和外源DNA末端都是由一种产生粘性末端的内切酶切割产生（同尾酶也可），或两者末端被接上一段互补的多聚体尾巴，经退火后可形成新的重组分子。连接后产生的重组分子中仍保留外源DNA两端的限制性内切酶切点，便于再次取出克隆的DNA段。

外源DNA片段和线状质粒载体的连接，是在双链DNA5'磷酸和相邻的3'羟基之间形成新的共价键。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯键；若质粒DNA已去磷酸化，则仅能形成2个新的磷酸二酯键，产生的杂交分子带有2个单链切口，导入感受态细胞后可被修复。相邻的5'磷酸和3'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由大肠杆菌DNA连接酶或T4噬菌体DNA连接酶催化。在有克隆用途中，T4噬菌体DNA连接酶是首选，因其在标准条件下能有效连接平端DNA片段。

DNA一端与另一端的连接是双分子反应，反应速度完全由互补末端的浓度决定。当连接混合物中只含有一种DNA（如用粘端限制酶切割的磷酸化载体DNA），DNA浓度低时有利于分子内连接（重新环化）；DNA浓度高时有利于分子间连接，形成二聚体或寡聚体。Dugaiczyk等从理论上探讨了DNA浓度对连接产物性质的影响，关键参数包括：

• j：DNA分子一个末端在同一分子另一末端附近的有效浓度，与DNA长度成反比，且对给定长度DNA为常数，与浓度无关。j = [3/(3πlb0)]^{3/2}，其中l为DNA长度（cm），b为随机卷曲区段长度。
• i：溶液中所有互补末端的浓度测值，i = 2NoMx10^{-3}末端/ml，No为阿伏伽德罗常数，M为DNA摩尔浓度（mol/L）。

当j=i时，分子内与分子间连接速率相等；j>i利于环化；i>j利于多联体形成。对于含线状质粒和外源DNA片段的混合物，当i是j的2-3倍且外源DNA末端浓度为质粒的2倍时，有效重组体产量最大，终产物约40%为单体质粒与外源DNA的嵌合体。

1. 用适当限制酶消化质粒和外源DNA，必要时用碱性磷酸酶处理质粒DNA。纯化后DNA用TE（pH7.6）溶液调整为100 ng/μl。

2. 设立连接反应混合物：将0.1 μl载体DNA转入无菌微量离心管，加等摩尔量外源DNA，加水至7.5 μl，45℃加热5分钟解链后冷却至0℃。加入：10x T4噬菌体DNA连接酶缓冲液1 μl，T4连接酶0.1 Weiss单位，5 mmol/L ATP 1 μl，16℃温育1-4小时。缓冲液组成为：200 mmol/L Tris·Cl (pH7.6)，50 mmol/L MgCl₂，50 mmol/L二硫苏糖醇，500 μg/ml牛血清白蛋白（可选）。对照反应需包含仅载体或仅外源DNA的样品。

3. 每个样品取1-2 μl转化大肠杆菌感受态细胞。载体DNA浓度应满足j:i>1且<3，对pUC18大小质粒约为20-60 μg/ml。外源DNA末端浓度应等于或稍高于载体DNA。

T4噬菌体DNA连接酶可催化平端DNA片段连接，此反应效率低，需满足：低浓度ATP（0.5 mmol/L）、无亚精胺等多胺、极高连接酶浓度（50 Weiss单位/ml）和高浓度平端。加入凝聚剂如聚乙二醇（PEG8000）或氯化六氨合高钴可大幅提高连接效率并改变产物分布。

聚乙二醇（PEG8000）的使用

1. 用去离子水配制40% PEG8000贮存液，分装冰冻保存。在15% PEG8000连接混合物中，刺激效应最显著。除PEG和酶外，其他组分于0℃混合，加室温PEG8000混匀，加酶后20℃温育。

2. 连接混合物含0.5 mmol/L ATP和5 mmol/L MgCl₂时刺激最显著。15% PEG8000可提高粘端连接效率10-100倍，产物主要为串联多联体。

3. PEG8000可刺激短至8个核苷酸的合成寡聚物平端连接。

氯化六氨合高钴的使用

1. 10 mmol/L贮存液于-20℃保存，连接混合物中终浓度1.0-1.5 μmol/L时刺激最大。平端连接效率提高约50倍，粘端提高约5倍。

2. 在30 mmol/L KCl存在下，对平端连接仍有刺激，但产物分布改变，环状DNA占优势。

3. 不能显著提高合成寡核苷酸连接速率。

宝生物工程（大连）有限公司的DNA连接系统（TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2）可缩短反应时间至30分钟，不受DNA结构影响。试剂盒内容包括：Solution I（酶溶液）250 μl×3，Solution II（缓冲液）750 μl×1。使用方法：取5 μl DNA溶液，加等量Solution I，16℃反应30分钟，直接用于转化或体外包装。对于线形DNA连接（如λgt11/EcoRI臂插入pBR322/EcoRI片段），需使用Solution II和两倍量Solution I，26℃反应10分钟。连接效率高于传统T4连接酶16小时反应。

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