CRISPR - Cas系统

系统组成与作用机制

1. CRISPR结构

CRISPR由前导序列（Leader）、重复序列（Repeat）和间隔序列（Spacer）组成 。前导序列富含AT碱基，是CRISPR转录的启动区域；重复序列长度通常为20 - 50bp，具有回文结构，可形成发夹状二级结构；间隔序列则来源于细菌以往遭遇的噬菌体或质粒等外源DNA片段，能够识别再次入侵的外源核酸 。

2. Cas蛋白

Cas蛋白是一类核酸酶，不同类型的CRISPR - Cas系统包含的Cas蛋白种类和数量各异 。例如，CRISPR - Cas9系统中的Cas9蛋白是一种多功能核酸酶，具有两个核酸酶结构域（HNH和RuvC），能够分别切割与gRNA互补配对的DNA链和非互补链 ；而CRISPR - Cas12a（又称Cpf1）蛋白仅含一个RuvC样核酸酶结构域，切割DNA后产生黏性末端 。

3. 作用过程

◦ 适应阶段：当细菌遭受外源核酸（如噬菌体DNA）入侵时，Cas蛋白会识别并切割外源DNA，将部分片段整合到自身的CRISPR间隔序列中，形成新的记忆 。

◦ 表达阶段：在外界刺激下，CRISPR序列转录生成前体crRNA（pre - crRNA），pre - crRNA在Cas蛋白或宿主RNaseⅢ的作用下，被加工成成熟的crRNA 。

◦ 干扰阶段：成熟的crRNA与反式激活crRNA（tracrRNA）结合形成复合物，该复合物与Cas蛋白结合，引导Cas蛋白靶向识别并切割与间隔序列互补的外源DNA 。在基因编辑应用中，常将tracrRNA和crRNA融合为一条单链向导RNA（sgRNA），简化操作流程 。

系统分类与特点

根据系统中核心Cas蛋白的类型和功能，CRISPR - Cas系统可分为两大类6个类型（Ⅰ - Ⅵ型） 。

1. 第一类系统：包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型，需要多个Cas蛋白形成复合物发挥功能 。以Ⅰ型为例，由Cas3等多个蛋白组成Cascade复合物，负责识别和结合靶DNA，Cas3则执行切割功能 。这类系统结构复杂，操作难度较大，但在自然界中分布广泛 。

2. 第二类系统：包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型，仅需单个Cas蛋白即可发挥作用 。其中Ⅱ型（CRISPR - Cas9）和Ⅴ型（CRISPR - Cas12a）因操作简便、效率高，成为基因编辑领域应用最广泛的工具 。Ⅵ型系统的Cas13蛋白能够特异性切割RNA，在RNA编辑和检测领域具有独特优势 。

在生命科学领域的应用

1. 基因功能研究

通过CRISPR - Cas系统对特定基因进行敲除、敲低或激活，观察生物体表型变化，从而解析基因功能 。例如，在模式生物小鼠中利用CRISPR - Cas9技术敲除特定基因，研究其在胚胎发育、疾病发生中的作用 。

2. 疾病治疗

◦ 基因治疗：针对单基因遗传病，如镰状细胞贫血、囊性纤维化等，可通过CRISPR - Cas系统纠正致病基因突变，修复缺陷基因 。

◦ 癌症治疗：一方面，可敲除肿瘤细胞中与耐药性相关的基因，增强化疗效果；另一方面，编辑免疫细胞（如T细胞），使其更好地识别和杀伤肿瘤细胞，如CAR - T细胞疗法与CRISPR技术的结合 。

3. 农业育种

用于改良农作物和家畜品种 。通过编辑作物基因，可提高作物的抗病性、抗逆性（如抗旱、抗盐）和产量 。例如，利用CRISPR - Cas9技术编辑水稻基因，培育出抗稻瘟病的水稻品种；在畜牧业中，编辑家畜基因，改善肉质、提高繁殖性能 。

4. 生物制药

加速药物研发进程 。通过构建基因编辑细胞系，可用于筛选药物靶点、评估药物疗效；还可改造微生物，使其高效合成药物活性成分，如利用基因编辑技术优化酵母菌的代谢途径，提高青蒿素前体的产量 。

面临的挑战与争议

1. 脱靶效应：尽管CRISPR - Cas系统具有较高的特异性，但仍可能出现向导RNA与非靶DNA序列的错配结合，导致非预期的基因编辑，引发不可预测的生物学后果 。

2. 递送难题：如何将CRISPR - Cas系统高效、安全地递送至靶细胞或组织，是限制其临床应用的关键因素之一 。目前常用的递送方法包括病毒载体（如腺相关病毒、慢病毒）和非病毒载体（如脂质体、纳米颗粒），但各有优缺点 。

3. 伦理与安全问题：人类生殖细胞的基因编辑可能导致遗传改变传递给后代，引发“设计婴儿”等伦理争议；同时，基因编辑技术对生态环境的潜在影响，如转基因生物的释放是否会破坏生态平衡，也备受关注 。