包涵体

包涵体是表达外源基因的宿主细胞（包括原核细胞如大肠杆菌，以及真核细胞如酵母、哺乳动物细胞）中形成的蛋白质聚集体。

在基因重组技术发展之前，研究者已发现细胞内引入的外源蛋白质会堆积成不溶的球形聚集体，这些聚集体通过非共价键作用力形成，需变性剂如SDS或盐酸胍才能溶解。基因工程蛋白质在大肠杆菌中过量表达时，同样形成不溶性包涵体。Georgiou等人发现，天然蛋白质如内酰氨酶和碱性磷酸酶过量表达时，也形成包涵体，分别位于外周质和细胞质。其他宿主如细菌病毒、哺乳动物细胞中也有类似现象。

温度是影响包涵体形成的主要因素。高温下蛋白质易变性聚集，而低温利于正确折叠。发酵条件如添加蔗糖、乙醇、低分子量巯基化合物等可减少包涵体形成。pH控制不佳或供氧不足也易导致包涵体形成。蛋白质的聚集现象广泛存在，与多肽链序列、表达速度、伴侣分子量和环境有关。

包涵体由部分折叠的中间体形成，而非完全解折叠的蛋白质。圆二色和Raman光谱显示其保持部分二级结构，ATR-FTIR发现其含较多非天然β-折叠结构。包涵体可在细胞质或外周质形成，直径0.2-1.5 μm，密度1.1-1.3，呈多孔结构。作用力主要为疏水相互作用，不含共价键。包涵体中95%为蛋白质，不含伴侣分子。

病毒包涵体是病毒感染后宿主细胞内形成的病变结构，光学显微镜下可见，多为圆形或卵圆形，由完整病毒颗粒或未装配亚基聚集而成。例如天花病毒包涵体（Guarnieri小体）位于细胞质，狂犬病毒包涵体（Negri小体）位于细胞核。昆虫病毒根据包涵体形状分为细胞质型多角体病毒、核型多角体病毒等。

提取包涵体需破坏细胞膜，常用高压匀浆法（2-5个循环），也可用超声、溶菌酶等方法。分离可采用过滤或离心法。离心法利用包涵体密度大于细胞碎片的特性，连续离心可获纯度>90%的包涵体。必要时用化学方法（如EDTA、Triton X-100）去除膜蛋白污染。

溶解包涵体需使用变性剂，常用离液剂（6-8 mol/L盐酸胍或尿素）或去垢剂（SDS、N-十二烷肌氨酸）。盐酸胍变性能力强，但成本高；尿素易被氰酸盐污染，需现配现用。去垢剂可保持部分生物活性，但难以去除，可用环状糊精提取。极端pH（≤2.6或≥12）也可溶解包涵体，但可能导致不可逆修饰。

大肠杆菌因生长快、成本低、遗传操作成熟，是重组蛋白主要表达系统。外源蛋白过量表达常形成包涵体，但其具有优势：抗蛋白酶降解、易于分离、可表达毒性蛋白、便于在线检测。包涵体不同于等电点或高盐沉淀，后者可逆且不改变构象，而包涵体需变性复性才能获得活性。

• 于文国, 陶秀娥. 包涵体蛋白复性及其影响因素[J]. 河北工业科技, 2007, (05).
• 宁云山, 李妍, 王小宁. 包含体蛋白质的复性研究进展[J]. 生物技术通讯, 2001, 12(3): 237-248.
• 王进, 华子春, 方勇, 等. 功率超声法对蛋白质包涵体的解聚[J]. 生物化学和生物物理进展, 1995, 22(6): 543-545.
• 耿信笃. 高效疏水色谱在蛋白质复性中应用[J]. 科学通报, 1994, 44(19): 2046-2049.
• 万雪, 王磊, 宁官保. 包涵体及其复性研究概况[J]. 畜牧兽医科技信息, 2005, (02).
• 井明艳, 孙建义. 蛋白质的折叠调控与包涵体的形成[J]. 浙江大学学报(农业与生命科学版), 2004, (06).
• 方敏, 黄华樑. 包涵体蛋白体外复性的研究进展[J]. 生物工程学报, 2001, (06).
• 冯小黎. 重组包涵体蛋白质的折叠复性[J]. 生物化学与生物物理进展, 2001, (04).
• 凌明圣, 许祥裕, 丁树标. 以包涵体形式存在的重组蛋白的纯化和体外折叠[J]. 中国生化药物杂志, 1995, (03).
• 杨晓仪, 林键, 吴文言. 重组蛋白包涵体的复性研究[J]. 生命科学研究, 2004, (02).
• 罗惠霞, 李敏, 王玉炯. 包涵体蛋白复性的几种方法[J]. 生物技术通报, 2007, (05).
• 高飞, 范清林, 邹文艺, 等. 包涵体蛋白的层析复性技术研究进展[J]. 生物技术通报, 2006, (02).
• 艾恒, 莫书荣, 鲁波. 包涵体研究进展[J]. 中国医学文摘·内科学, 2006, (02).
• 邹平. 重组包涵体蛋白质复性[J]. 厦门科技, 2005, (05).
• 吉清, 何凤田. 包涵体复性的研究进展[J]. 国外医学·临床生物化学与检验学分册, 2004, (06).
• 高永贵, 关怡新, 姚善泾. 包涵体蛋白的变复性研究[J]. 科技通报, 2003, (01).
• Sunitha K, Chung B H, Jang K-H, et al. Refolding and purification of Zymomonas mobilis levansucrase produced as inclusion bodies in fed-batch culture of recombinant Escherichia coli[J]. Protein Expression and Purification, 2000, 18: 338-393.
• De Bernardez Clark E. Protein refolding for industrial processes[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2001, 12(2): 202-207.
• Singh A, Upadhyay V, Panda AK. Solubilization and refolding of inclusion body proteins[J]. Methods in Molecular Biology, 2015, 1258: 283-291.
• Burgess RR. Refolding solubilized inclusion body proteins[J]. Methods in Enzymology, 2009, 463: 259-282.