敲除

基因敲除（Knockout, KO）是一种通过靶向失活特定基因来研究其功能的遗传学技术，广泛应用于疾病机制解析、药物靶点验证及基因治疗开发。以下从技术原理到前沿应用进行系统解析：

一、技术原理与核心方法

1. 传统基因敲除技术

2. CRISPR-Cas9革命（当前主流）

• 机制：
  gRNA引导Cas9核酸酶靶向切割DNA→细胞通过NHEJ（非修复）或HDR（同源修复）修复→引入移码突变/插入缺失（Indel）导致基因失活。

• 核心优势：
  ✅ 构建简单（仅需设计gRNA）
  ✅ 多基因同时敲除（多重gRNA）
  ✅ 效率提升10-100倍（细胞系可达＞80%）

二、关键实验设计策略

1. 靶点选择原则

• 功能域靶向：优先敲除外显子编码关键结构域（如激酶活性中心）。

• 移码热点：选择基因5'端外显子，提高无义介导降解（NMD）概率。

2. 递送系统优化

3. 脱靶效应控制

• 高保真Cas9变体：如SpCas9-HF1（突变点：N497A/R661A等）降低非特异性切割。

• 预测工具：

  • CIRCLE-seq：体外全基因组脱靶位点检测。

  • Guide-seq：细胞内存活检测脱靶位点。

三、前沿变体技术

1. 条件性基因敲除（cKO）

• Cre-loxP系统：

  • 在目标基因两侧插入loxP位点→组织特异性表达Cre重组酶→切除关键外显子。

  • 光控升级：融合Cre-CRY2/CIB1→蓝光诱导基因敲除（时空精准）。

• 应用实例：
  大脑神经元特异性敲除BDNF→解析学习记忆机制。

2. CRISPRi（干扰性敲低）

• dCas9-KRAB：

  • 失活Cas9（dCas9）融合转录抑制域KRAB→阻断转录起始（可逆敲低）。

• 优势：避免完全敲除致死基因，适用于必需基因研究。

3. 碱基编辑（Base Editing）

• 原理：dCas9融合脱氨酶→直接转换碱基（如C→T）→引入提前终止密码子（TAA/TAG/TGA）。

• 适用：无需DSB即可实现基因敲除（降低染色体缺失风险）。

四、应用场景与里程碑案例

1. 疾病机制研究

• 肿瘤学：

  • 敲除TP53→加速小鼠肺癌模型构建（验证驱动基因功能）。

• 神经科学：

  • FMR1基因敲除→模拟脆性X综合征（揭示mRNA翻译失调机制）。

2. 药物开发

• 靶点验证：

  • CRISPR筛选发现*PD-L1*敲除增强T细胞杀伤→推动免疫检查点抑制剂开发。

• 毒性评估：

  • 敲除CYP450基因→预测药物代谢风险（人源化肝嵌合小鼠模型）。

3. 基因治疗

• HIV治愈探索：

  • CCR5Δ32敲除（模仿天然突变）→构建HIV抗性CAR-T细胞（临床试验：NCT04648046）。

• 遗传病治疗：

  • 体内CRISPR敲除TTR基因→治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性（NTLA-2001疗法获FDA加速批准）。

五、挑战与解决方案

1. 完全敲除难题

• 问题：
  多拷贝基因/必需基因难以完全失活。

• 对策：

  • 多重gRNA靶向所有拷贝 + FACS分选纯合敲除细胞。

  • 条件性敲除（cKO）避免发育致死。

2. 基因补偿效应

• 现象：
  同源基因代偿（如MyoD敲除后Myf5上调掩盖表型）。

• 验证方法：

  • 双基因敲除（DKO）或蛋白质组学检测补偿表达。

3. 体内递送瓶颈

• 器官靶向：

  • 脂质纳米颗粒（LNP）包裹CRISPR组分→肝靶向效率＞90%（临床已应用）。

  • AAV-PHP.eB变体突破血脑屏障（脑细胞转导率提升10倍）。

六、未来方向

1. 超精准基因编辑

• Prime Editing：

  • 逆转录酶融合nCas9→通过pegRNA模板直接写入新序列→实现任意类型突变（可逆敲除）。

2. 人工智能辅助设计

• DeepCRISPR：

  • 机器学习预测高活性gRNA及脱靶风险（AUC＞0.9）。

3. 表观遗传敲除

• CRISPRoff：

  • dCas9-DNMT3A/KRAB→甲基化沉默基因（可遗传且可逆）。

总结

基因敲除技术从同源重组的低效时代迈入CRISPR主导的精准时代，其核心价值在于：
✅ 因果关联验证（从相关性到机制解析）
✅ 治疗靶点确证（加速药物研发进程）
✅ 基因疗法基石（从罕见病到肿瘤免疫）

2024突破：全球首例体内CRISPR基因敲除疗法（Verve公司的VERVE-101）成功降低家族性高胆固醇血症患者LDL-C水平57%，标志着心血管疾病基因治疗的里程碑。