病毒示踪

病毒示踪

Viral Tracing

1. 概述

病毒示踪 是一种利用 嗜神经病毒 的天然特性，在活体动物中标记和追踪神经元之间 解剖学连接 的强大技术。通过选择特定种类的病毒并设计实验方案，研究者可以实现 顺行追踪、逆行追踪 或 跨突触追踪，从而绘制出神经环路在 细胞分辨率 上的输入与输出图谱。该技术是构建 介观连接组 和研究特定环路功能架构的核心工具。

2. 基本原理

不同的嗜神经病毒具有不同的生命周期和传播特性，可利用这些特性进行示踪：

• 顺行示踪： 病毒在注射位点的神经元胞体内复制后，其病毒颗粒或标记蛋白沿 轴突 顺向运输至该神经元的 下游靶区，从而标记其输出连接。

• 逆行示踪： 病毒被注射位点区域的神经元 轴突末梢 摄取，然后沿轴突逆行运输至 上游神经元 的胞体，从而标记其输入来源。

• 跨多级突触示踪： 某些病毒能够从一个神经元跨越突触传递至与其直接相连的神经元，并继续传播，从而标记 多级连接 的环路。

3. 常用病毒载体及其特性

4. 关键技术策略与变体

4.1 单突触环路追踪

这是最精确、最常用的环路追踪策略，以 狂犬病毒系统 为代表。

• 原理：

  1. 首先，利用 AAV 向目标脑区注射两种辅助元件：

     • 狂犬病毒糖蛋白： 允许病毒包裹并出芽。

     • TVA受体： 允许病毒感染。

  2. 这些AAV通常由 细胞类型特异性启动子 驱动，确保只在一类“起始细胞”中表达。

  3. 然后，注射 缺失糖蛋白和TVA受体的假型狂犬病毒。该病毒只能感染表达了TVA受体的“起始细胞”，并在其中复制。

  4. 由于辅助的糖蛋白存在，病毒能从“起始细胞”的 突触前末梢 出芽，但 只能感染与它直接形成突触连接的上一级神经元（即单突触前神经元），而无法继续传播。

• 结果： 精确标记所有 直接向目标细胞类型提供输入的神经元，绘制其单突触输入图谱。

4.2 顺行跨多级追踪

使用 VSV 或改造的 HSV，从注射位点顺向跨突触传播，标记下游多级环路。

4.3 结合光学清除与成像

将病毒示踪与 组织透明化技术（如CLARITY, iDISCO）和 光片显微镜 结合，实现全脑尺度、单细胞分辨率的投射三维重构。

4.4 结合功能操控

使用 携带光敏感通道或化学受体基因的病毒，在标记环路的同时，实现对特定环路节点的 光遗传学 或 化学遗传学 操控，进行结构与功能双重解析。

5. 实验流程

1. 病毒选择与设计： 根据研究目的（顺/逆/跨突触、细胞类型特异性）选择或构建病毒。

2. 立体定位注射： 在麻醉动物上，使用脑立体定位仪将微量病毒精准注射到目标脑区。

3. 存活期： 给予足够时间让病毒被摄取、运输、复制和表达报告蛋白（通常数天至数周）。

4. 灌注与取样： 麻醉动物，经心脏灌流固定大脑。

5. 组织处理与成像：

   • 制备脑切片进行荧光显微镜观察。

   • 或进行全脑透明化处理，用光片显微镜进行三维成像。

6. 数据分析： 识别标记的神经元胞体和轴突纤维，绘制连接图谱，进行定量分析（如计数、投射强度测量）。

6. 优势

• 高灵敏度与信噪比： 病毒复制可放大信号，背景低。

• 细胞分辨率： 可以清晰看到单个被标记神经元的完整形态（胞体、树突、轴突）。

• 环路特异性： 结合遗传学工具，可特异性地标记特定细胞类型参与的环路。

• 可跨突触： 能够揭示多级、长程的环路连接，这是传统染料示踪难以实现的。

• 多功能整合： 可与报告基因、操控工具结合，实现“标记-记录-操控”一体化。

7. 局限性与挑战

• 毒性： 复制型病毒（如狂犬、伪狂犬）对细胞有毒性，存活时间窗口有限。

• 传播效率不均： 不同种类的突触，病毒跨突触的效率可能不同，可能导致图谱偏差。

• 假突触传播风险： 病毒可能通过非突触机制（如细胞外间隙）短距离扩散，造成假阳性。

• 个体操作差异： 注射位点、体积、滴度的微小差异可能导致结果变异。

• 数据解析复杂： 全脑三维成像数据量巨大，自动化分析和标准化定量仍是挑战。

8. 典型应用场景

1. 绘制脑区输入/输出图谱： 如利用顺行/逆行AAV，系统性描绘小鼠全脑的介观连接组（如 Allen Mouse Brain Connectivity Atlas）。

2. 解析特定功能环路的细胞组成： 如利用狂犬病毒系统，找出所有直接投射到某个调控“恐惧记忆”的杏仁核神经元的上游脑区。

3. 验证计算模型的预测： 用实验数据验证基于功能成像或理论计算推测的环路连接。

4. 疾病模型环路异常研究： 比较在神经精神疾病模型中，特定环路的连接强度或模式是否发生改变。

9. 参考文献

1. Wickersham, I. R., et al. (2007). Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron, 53(5), 639-647. （单突触狂犬病毒系统奠基）

2. Oh, S. W., et al. (2014). A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature, 508(7495), 207-214. （AAV用于大规模介观连接组）

3. Callaway, E. M., & Luo, L. (2015). Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses. Journal of Neuroscience, 35(24), 8979-8985. （方法学综述）

4. Kim, E. J., et al. (2019). Extraction of distinct neuronal cell types from within a genetically continuous population. Neuron, 107(2), 274-282. （病毒策略应用实例）

5. Allen Institute for Brain Science. Allen Mouse Brain Connectivity Atlas. (在线资源： https://connectivity.brain-map.org/)

10. 总结

病毒示踪技术是现代神经环路研究的 “绘图仪”和“探针” 。它将分子生物学工具与神经解剖学完美结合，使我们能够以前所未有的精度和广度，在活体大脑中逆向工程其复杂的布线逻辑。随着新型病毒工具的开发（如更安全、更高效、更多颜色的病毒）以及与大尺度成像、计算分析的深度整合，病毒示踪将继续是解密大脑连接组并阐明其功能意义的核心驱动力。