条件性基因敲除

条件性基因敲除 （Conditional Gene Knockout）

条件性基因敲除（Conditional gene knockout， cKO）是一种先进的遗传操作技术（Genetic manipulation technique），允许研究者在特定组织（Specific tissue）、特定发育阶段（Specific developmental stage）或特定生理条件下，对目标基因的功能进行时空特异性（Spatiotemporally specific）的失活。它克服了传统全身性基因敲除（Conventional knockout）常因胚胎致死或全身多系统缺陷而无法研究基因在特定情境下功能的局限，是现代功能基因组学（Functional genomics）和疾病研究的关键工具。

1. 核心原理与系统

条件性基因敲除的实现主要依赖于两个分子遗传学系统的结合：

• 1.1 Cre-loxP 系统

  • 这是应用最广泛的系统。Cre重组酶（Cre recombinase）是一种来自P1噬菌体的酶，能特异性识别并催化两个loxP位点（34bp的特异DNA序列）之间的DNA重组。

  • 若两个loxP位点以相同方向位于同一DNA分子上，Cre介导的剪切会切除两个loxP位点间的DNA片段，导致该片段（通常是关键外显子）的永久性缺失，从而实现基因敲除。

  • 核心策略：将目标基因的关键编码区两侧插入loxP位点（“floxed” allele， flanked by loxP）。该“floxed”小鼠本身基因功能正常。当与另一株在特定细胞类型中表达Cre重组酶的转基因小鼠（Cre driver line）杂交后，在表达Cre的细胞中，floxed区段被切除，基因功能丧失。

• 1.2 其他类似系统

  • Flp-FRT系统：原理与Cre-loxP类似，使用酵母来源的Flp重组酶和FRT位点。常与Cre系统联用进行更复杂的遗传操作。

  • Dre-rox系统：另一个正交的重组酶系统，用于多重调控。

2. 实现时空特异性的方式

• 组织/细胞类型特异性：使用组织特异性启动子（Tissue-specific promoter）驱动Cre表达。例如，Alb-Cre在肝细胞中表达，Nestin-Cre在神经前体细胞中表达。

• 时间特异性：

  • 诱导型系统：将Cre与药物诱导的蛋白结构域融合。最常用的是CreERT2（Cre与突变的人雌激素受体配体结合域融合）。在给予外源性药物他莫昔芬（Tamoxifen）后，CreERT2被激活并转运入核，执行重组。这允许研究人员在任意选定的时间点（如成年期）诱导基因敲除。

  • 发育阶段特异性：使用在特定发育阶段激活的启动子驱动Cre。

3. 主要应用

• 研究胚胎致死基因的出生后功能：对于全身敲除导致胚胎死亡的生存基因（Survival gene），可研究其在特定器官出生后的作用。

• 解析基因的细胞自主性功能：在复杂组织中（如大脑），精确敲除特定细胞类型（如神经元、胶质细胞）中的基因，以区分其作用是细胞自主性的还是通过细胞间通讯介导的。

• 建立疾病模型：模拟人类疾病中常见的体细胞突变或组织特异性基因失活，如构建特定组织（肺、肝、脑）的肿瘤抑制基因（Tumor suppressor gene）条件敲除模型来研究癌症发生。

• 剖析基因的多重功能：同一个基因在不同组织或生命阶段可能发挥不同甚至相反的作用，条件性敲除可以逐一揭示这些功能。

• 绕过 遗传冗余（Genetic redundancy）：在特定组织中敲除一个基因，可能因冗余而表型微弱，但可通过构建组织特异性双敲除来揭示其功能。

4. 优势与局限性

• 优势：

  • 高时空精度，极大提高了基因功能研究的特异性。

  • 能研究胚胎致死基因、多效性基因。

  • 可诱导性允许进行“前后对照”研究，并避免发育补偿的干扰。

• 局限性与注意事项**：

  • Cre表达的“渗漏”：某些Cre品系在非目标组织或有基础活性。

  • 他莫昔芬的副作用：可能对细胞或动物本身有毒性或脱靶效应。

  • 重组效率不足：可能导致基因敲除不完全，表型分析复杂化。

  • 脱靶效应：loxP位点可能插入基因组非预期位置，或Cre本身可能具有毒性。

  • 品系维护复杂：需要同时维持和基因型鉴定多个转基因品系。

5. 技术发展

随着CRISPR-Cas9技术的发展，出现了基于CRISPR的条件性基因编辑策略，例如使用组织特异性启动子驱动Cas9，或开发可诱导的Cas9（如Cas9-ERT2），为条件性基因失活提供了更灵活、更快速的替代方案。

参考文献

1. Nagy, A. (2000). Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis, 26(2), 99-109. （关于Cre-loxP系统原理与应用的经典综述）

2. Feil, R., et al. (1997). Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochemical and Biophysical Research Communications, 237(3)， 752-757. （报道了CreERT2诱导系统的开创性工作）

3. Sauer, B., & McDermott, J. (2004). *DNA recombination with a heterospecific Cre homolog identified from comparison of the pac-c1 regions of P1-related phages*. Nucleic Acids Research, 32(20), 6086-6095. （介绍了其他重组酶系统如Dre）

4. Schwenk, F., Baron, U., & Rajewsky, K. (1995). A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Research, 23(24)， 5080-5081. （展示了条件性敲除在特异性细胞类型中的应用）

5. Dow, L. E., & Lowe, S. W. (2012). Life in the fast lane: mammalian disease models in the genomics era. Cell, 148(1-2)， 1099-1109. （综述了包括条件性敲除在内的基因工程小鼠模型在疾病研究中的应用与价值）