5-羧基胞嘧啶

5-羧基胞嘧啶（5-carboxylcytosine， 5caC）是DNA中胞嘧啶的一种氧化修饰形式，由Tet家族双加氧酶（Tet1/2/3）连续催化5-甲基胞嘧啶的第三步，也即最后一步氧化而产生（5mC → 5hmC → 5fC → 5caC）。它是主动DNA去甲基化通路中Tet催化的氧化反应的终产物，是随后被胸腺嘧啶DNA糖基化酶识别并切除的直接前体。5caC在基因组中丰度极低，是已知丰度最低的DNA修饰之一，但其在完成去甲基化循环中扮演着不可替代的终结者角色。

1. 生物合成与检测

• 生物合成：Tet蛋白在催化生成5-醛基胞嘧啶后，可进一步将其氧化，将醛基（-CHO）转化为羧基（-COOH），从而生成5caC。这被认为是Tet蛋白对5mC氧化反应的终端步骤。

• 检测挑战：由于其丰度极低（甚至低于5fC），检测需要超高灵敏度和特异性的技术。

  • 化学生物学方法：利用其羧基的化学反应性，通常需要先进行化学衍生化（如与胺基化合物偶联）以引入标签，再进行富集和测序分析。

  • 基于抗体的方法：特异性抗体可用于免疫沉淀，但难度极高。

2. 分子特性与核心功能

• 化学特性：带有羧基，使其具有酸性，可能影响DNA的局部化学环境。

• 核心功能：作为TDG的最佳底物。胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）对5caC（以及与5caC配对的鸟嘌呤）的识别和切除效率远高于对5fC和5hmC。因此，5caC的生成标志着氧化步骤完成，并高效启动了最终的切除修复步骤。

• 去甲基化途径：5caC被TDG切除后，产生无碱基位点，随后通过碱基切除修复通路（涉及APE1、DNA聚合酶β、DNA连接酶）插入一个未甲基化的胞嘧啶，从而完成从5mC到C的完整去甲基化循环。

3. 基因组分布与潜在角色

尽管丰度极低，研究仍提示其分布可能具有非随机性：

• 分布：预期存在于正在进行主动去甲基化的基因组位点，如特定增强子或启动子区域。但由于技术限制，其全基因组精细图谱的绘制极具挑战。

• 潜在角色：

  • 去甲基化终末信号：其主要生物学角色被广泛认为是作为Tet氧化途径的终点和TDG修复途径的起点，即充当一个高效的“切除信号”，确保去甲基化过程精确完成。

  • 独立的表观遗传信号？：理论上，羧基可能被特定蛋白质识别。然而，鉴于其丰度极低且存在时间可能非常短暂（被TDG快速切除），其作为一个稳定的、具有独立调控功能的表观遗传标记的可能性远低于5hmC，甚至低于5fC。目前尚无强有力证据支持其独立于修复通路之外的调控功能。

4. 在生物学与疾病中的意义

• 发育与细胞功能：5caC的生成和及时清除对于胚胎发育、细胞分化等过程中精确的DNA甲基化重编程至关重要。TDG缺陷导致5caC积累，在小鼠中引起胚胎致死，证明了该通路的重要性。

• 癌症：在TET2突变或*IDH1/2*突变的癌症中，由于Tet酶活性受损，5caC的生成预计会减少，这可能阻碍了特定肿瘤抑制基因位点的正常去甲基化激活。然而，直接检测肿瘤中5caC的变化在技术上仍非常困难。

5. 研究挑战

• 检测技术的极限：开发能准确定量、无偏检测全基因组5caC的方法是目前表观遗传学技术的前沿挑战之一。

• 功能分离：很难在体内实验中将5caC作为“信号分子”的功能与其作为“修复底物”的核心功能分离开来。

• 动态追踪：研究其产生和清除的实时动力学非常困难。

6. 与5hmC和5fC的关系

5caC与5hmC、5fC共同构成了从5mC到未甲基化C的完整氧化去甲基化路径。三者形成一个丰度递减（5hmC >> 5fC > 5caC）、功能各有侧重的连续谱系：5hmC可能是稳定的调控标记；5fC可能是中间信号和修复底物；而5caC则主要扮演高效的修复底物和通路终产物的角色。

参考文献

1. Ito, S., et al. (2011). *Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine*. Science, 333(6047)， 1300-1303. （里程碑研究，首次报道Tet蛋白能催化生成5fC和5caC）

2. He, Y. F., et al. (2011). *Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA*. Science, 333(6047)， 1303-1307. （与Ito等同期发表，独立发现5caC并阐明其被TDG高效切除）

3. Maiti, A., & Drohat, A. C. (2011). *Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: potential implications for active demethylation of CpG sites*. Journal of Biological Chemistry, 286(41)， 35334-35338. （生化研究证实TDG对5caC具有极高的切除活性）

4. Hashimoto, H., et al. (2012). *Excision of 5-carboxylcytosine by thymine DNA glycosylase and the role of the base excision repair pathway*. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 78, 83-91. （进一步阐述了5caC在BER通路中的作用）

5. Shen, L., et al. (2013). *Genome-wide analysis reveals TET- and TDG-dependent 5-methylcytosine oxidation dynamics*. Cell, 153(3)， 692-706. （全基因组水平研究了5mC氧化产物的动态，包括5caC）