两染细胞

其涉及与心肌肥大相关的MR－1基因功能，动物体内实验证明了该基因的高表达，其加剧了AngⅡ对心肌肥大、炎症及纤维化的作用，证明MR－1的作用机制是通过对核因子NF－κB信号通路的调控，干扰MR－1的表达可以降低和削弱AngⅡ对NF－κB信号通路的诱导，说明降低或阻断MR－1基因的表达，有望成为治疗心肌肥大相关疾病的新靶点。

心肌细胞肥大(cardiomyocytehypertrophy)是高血压、心脏瓣膜病、急性心肌梗塞及先天性心脏病等临床常见疾病的一种并发症，是心肌细胞对多种病理刺激的一种适应性反应。目前虽然认为心肌肥大的发病机制与细胞外的心肌肥大因子刺激、细胞内的信号转导和核内的某些基因活化有关，但其最本质的特征是心肌细胞基因表达的异常。大量研究表明，肥大因子刺激30min即可诱发一系列即刻早期反应基因，如c-fos、c-myc、c-jun、egr-1等进行表达，其后一些心肌肥大标志基因，如MHC、ANF、BNP等被活化，最后是一些心肌收缩蛋白基因，如MLC-2、α-actin等表达上调。近年证实，无论何种刺激信号，往往都是通过激活一系列与心肌肥大发生相关的转录因子，包括Spl、Elk-1、SRF、MEF-2、GATA-4和LIM等而诱发心肌肥大的发生。LIM蛋白是一类富含半胱氨酸且分子结构中具有一个或多个锌指结构的蛋白质家族，该家族成员广泛参与多种细胞的发育与分化调节及多种基因的转录调控。hhlim是新近从胎儿心脏中分离和克隆的与心脏发生相关的基因，因其编码产物与LIM蛋白家族高度同源且氨基酸序列中含有典型的LIM结构域而得名。目前发现，hhlim在自发性高血压大鼠和心肌肥厚大鼠的心肌细胞中表达活性增强，但对其是否直接参与心肌细胞肥大的发生过程及作用机制还不清楚。本文在对hhlim基因表达调控机制进行研究的基础上，从整体、细胞和分子水平上探讨该基因在心肌肥大发生发展中的意义及其作用机制。
1hhlim表达调控机制的研究
hhlim是用三元递减法从人胎心cDNA文库中筛选克隆到一个与心脏生长发育有关的新基因。为了探讨hhlim基因的表达调控机制，将该基因5’侧翼区(长约2550bp)不同长度的片段与荧光素酶报告基因重组后，转染小鼠成肌细胞C2C12，确定其表达调控区域，并在此基础上，观察内皮素-1(ET-1)和碱性成纤维细胞生成长因子(bFGF)对该基因表达的影响。实验结果如下：
1.1在被马血清诱导(分化型)或不诱导(未分化型)的C2C12细胞中，从hhlim基因5’上游-2537bp序列依次进行缺失的9种不同长度的DNA片段均可驱动荧光素酶表达，其中，以转录起始点至5’上游-253bp(pF8)驱动荧光素酶基因表达的活性最高，比-2537bp(pF1)高9.9倍，比-157bp(pF9)高2.95倍。除-2037bp(pF2)片段的活性与-157bp(pF9)相近外，其它片段均有较高的活性。两种表型的C2C12细胞相比，除pF2和pF8之外，其它片段驱动荧光素酶表达的活性在分化型细胞均高于未分化型细胞。
1.2EMSA表明，从分化型和未分化型C2C12细胞中提取的核蛋白都可与hhlim基因上游-293～+16bp片段相结合，在4％PAGE上前者出现两条滞后带，后者出现一条滞后带，由此说明，两种表型细胞的核蛋白中均含有与-293～+16bp片段特异性结合的蛋白因子，但蛋白因子的种类和/或与顺式元件的相互作用方式可能不同。
1.3用在分化型C2C12细胞中表达活性较高的pF5转染C2C12细胞，在用马血清诱导被转染细胞进行分化的同时，加入心肌细胞肥大刺激因子ET-1和bFGF，观察两种因素对报告基因表达的影响。结果显示，ET-1和bFGF作用于C2C12细胞24h后，荧光素酶活性在被ET-1刺激的细胞中显著升高(达未刺激细胞的1.6倍)，至48h，其活性仍高于对照细胞；bFGF虽然也能促进荧光素酶表达，但荧光素酶活性升高的幅度在24h低于被ET-1刺激的细胞，在48h，略高于被ET-1刺激的活性。
1.4RT-PCR结果显示，处于分化过程中的C2C12细胞被ET-1和bFGF刺激后，hhlim表达活性分别于12h和6h开始升高，24h和48h达到高峰，在该时间点，其表达活性分别比对照细胞高出4.5倍和3.38倍。
上述结果提示，转录起始点至5’上游-253bp在该基因表达调控中起重要作用，其顺式作用元件与转录因子相互作用具有多样性和复杂性，该基因表达受ET-1和bFGF的调节。
2hhlim基因表达产物的亚细胞定位及其在细胞肥大中的意义
hhlim作为与心脏生长发育有关的基因被克隆，并发现其在自发性高血压大鼠和心肌肥厚大鼠的心肌细胞中表达活性增强。然而，关于hhlim是否能直接引起心肌细胞肥大及其引起心肌细胞肥大的作用机制还不明了。本部分实验以与心肌细胞结构相似且易于转染外源基因的小鼠成肌细胞C2C12为强制性表达外源性hhlim基因的细胞，观察hhlim基因表达产物的亚细胞定位及其在细胞肥大中的作用。结果如下：
2.1用脂质体转染方法将真核表达载体携带的外源性hhlim基因导入处于分化过程中的C2C12细胞，证实该基因强制性表达可使C2C12细胞体积明显增大。
2.2Westernblot分析结果显示，在未分化型C2C12细胞中检测不到α-actin的存在，未分化型C2C12细胞被外源性hhlim转染后，α-actin出现低量表达，说明hhlim强制性表达可诱导未分化型C2C12细胞表达α-actin；在被马血清诱导分化的C2C12细胞中，hhlim强制性表达使α-actin含量急剧增加，比未分化型细胞增加8.07倍，比未转染hhlim的细胞升高1.71倍。
2.3RT-PCR结果显示，在未分化型C2C12细胞中BNP表达活性较高，在被马血清诱导分化成熟的C2C12细胞中BNP不表达，C2C12细胞被外源性hhlim转染后再经马血清诱导时，该基因的表达又被显著诱导。
2.4用绿色荧光蛋白-hhlim融合蛋白表达载体转染处于分化过程的C2C12细胞，发现转染不同时间，表达产物的亚细胞定位发生动态变化，表现为先在胞核和胞质中均有分布，而后定位于胞质的变化规律。在ET-1诱导下，内源性hhlim的亚细胞定位也发生动态变化，表现为诱导24h时，hhlim蛋白在细胞质和细胞核中均有分布，但主要集中分布在胞核中，诱导48h后，细胞核中的红色荧光明显减弱，胞质荧光强度显著增强。
2.5以hhlim抗体和蛋白A-Sepharose对C2C12细胞裂解液进行免疫沉淀后，用抗α-actin抗体进行Westernblot分析的结果表明，在分化型细胞，hhlim抗体可以使α-actin共沉淀，即沉淀物中出现明显的α-actin条带；在转染hhlim后的分化型细胞，条带明显加深；转染hhlim的未分化型细胞中α-actin条带很浅，在未分化型C2C12细胞中检测不到α-actin的存在。免疫双荧光分析结果显示，TRITC标记的hhlim蛋白与FITC标记的α-actin荧光相互重合为黄色荧光。提示，hhlim在胞质中以与α-actin相互缔合的方式存在。
上述结果提示，在C2C12细胞从未分化型向分化型转化的早期，hhlim蛋白主要存在于核内，此时可能发挥启动心肌细胞肥大相关基因表达的作用；在分化型细胞中，hhlim蛋白主要分布于胞质中，胞质中的hhlim可能以与α-actin相互缔合的方式参与细胞骨架的构成。
3hhlim对心肌肥大的影响及其作用机制探讨
第二部分研究表明，hhlim具有启动C2C12细胞肥大相关基因表达及引发细胞肥大的作用。为进一步研究其是否也能引起心肌细胞肥大，本部分用携带hhlimcDNA的真核表达载体转染心肌细胞后，观察其强制性表达对心肌肥大的影响，并通过检测心肌细胞肥大相关基因表达的变化，探讨hhlim致心肌肥大的作用机制。实验结果如下：
3.1在原代心肌细胞中，hhlim基因表达活性较低，ET-1作用48h后，其表达被显著诱导，表达活性达对照细胞的2.12倍。BNPmRNA在原代培养的细胞中不能被检出，ET-1作用于细胞48h或转染hhlim基因48h后，BNP表达活性显著升高。
3.2RT-PCR结果表明，心肌细胞被可表达hhlim反义RNA的重组质粒转染后，BNP的表达明显下调，其表达活性比相应对照细胞降低了71％。Westernblot结果显示，hhlim强制性表达可使心肌细胞α-actin水平比转染空载体的细胞升高146.05％，转染反义hhlim后，α-actin含量比相应对照细胞下降61.97％。
3.4hhlim在原代心肌细胞中的强制性表达