免疫印迹

免疫印迹（Western Blot）是一种广泛应用于蛋白质检测和分析的实验技术，通过电泳分离、转膜及抗体特异性识别，实现对目标蛋白的定性和半定量分析。以下是关于Western Blot的全面总结：

1. 基本原理

• 三步核心流程：

  1. 电泳分离：利用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）按分子量分离蛋白质。

  2. 转膜：将凝胶中的蛋白质转移至固相载体（如PVDF膜或硝酸纤维素膜）。

  3. 免疫检测：通过特异性抗体结合目标蛋白，化学发光或显色法可视化信号。

2. 实验步骤详解

（1）样本制备

• 裂解液：含SDS、Triton X-100等去垢剂，破坏细胞膜并释放蛋白质。

• 蛋白酶抑制剂：防止蛋白质降解（如PMSF、EDTA）。

• 变性处理：煮沸样本（95°C，5分钟）使蛋白质线性化，暴露抗原表位。

（2）SDS-PAGE电泳

• 凝胶组成：

  • 分离胶（下层）：高浓度丙烯酰胺（如12%），分离不同分子量蛋白。

  • 浓缩胶（上层）：低浓度丙烯酰胺（如5%），浓缩样本成窄带。

• Marker选择：预染蛋白Marker用于实时追踪电泳进程。

• 电泳条件：恒压（80-120 V）至染料迁移至凝胶底部。

（3）转膜（Blotting）

• 转膜方式：

  • 湿转：适用于大分子蛋白（>100 kDa），耗时较长（1-2小时）。

  • 半干转：快速（15-30分钟），适合小分子蛋白（<50 kDa）。

• 膜选择：

  • 硝酸纤维素膜：高亲和力，成本低，但易碎。

  • PVDF膜：机械强度高，需预浸泡甲醇激活。

（4）封闭（Blocking）

• 封闭剂：5%脱脂牛奶或BSA（牛血清白蛋白），封闭膜上非特异性结合位点。

• 时间：室温1小时或4°C过夜。

（5）抗体孵育

• 一抗孵育：

  • 稀释比例（1:500至1:5000），4°C过夜或室温2小时。

  • 常用抗体类型：单克隆抗体（高特异性）或多克隆抗体（高灵敏度）。

• 二抗孵育：

  • 酶标二抗（如HRP标记的抗小鼠IgG），室温1小时。

  • 稀释比例通常为1:2000至1:10000。

（6）信号检测

• 化学发光法（ECL）：

  • HRP催化鲁米诺底物发光，通过X光胶片或化学发光成像仪捕获信号。

  • 灵敏度高，可检测pg级蛋白。

• 显色法（如DAB）：生成可见沉淀条带，适用于半定量分析。

（7）数据分析

• 软件工具：ImageJ、Quantity One等分析条带灰度值，计算相对表达量。

• 内参蛋白：β-actin、GAPDH或Tubulin，校正样本上样量差异。

3. 应用领域

• 基础研究：

  • 验证基因过表达/敲低后目标蛋白水平变化。

  • 检测蛋白质翻译后修饰（如磷酸化、泛素化）。

• 临床诊断：

  • HIV确诊（检测病毒抗原gp120/gp41）。

  • 自身免疫病抗体检测（如抗dsDNA抗体）。

• 药物开发：

  • 评估药物对靶蛋白的调控作用（如激酶抑制剂效果验证）。

4. 关键试剂与设备

5. 常见问题与解决方案

6. Western Blot与其他技术的比较

7. 技术进展

• 自动化Western（如Simple Western）：微流控技术实现全自动分析，减少人为误差。

• 荧光Western Blot：使用荧光标记二抗，多重检测（同一膜上分析多个靶蛋白）。

• 数字化定量：结合AI算法优化条带分析，提高重复性和准确性。

• 免转膜技术：原位检测凝胶中蛋白（如近红外荧光染色）。

8. 注意事项

• 抗体验证：使用阳性/阴性对照验证抗体特异性。

• 样本处理：避免反复冻融，分装保存。

• 膜保存：检测后可剥离抗体（Strip Buffer），重复使用检测其他蛋白。

总结

Western Blot作为蛋白质研究的“金标准”，通过高特异性的抗原-抗体反应，实现对目标蛋白的精确分析。尽管操作步骤繁琐且耗时，但其在基础研究、疾病诊断及药物开发中不可替代。随着自动化设备和新型检测技术的出现，Western Blot正朝着更高通量、更灵敏的方向发展，持续推动生命科学领域的进步。