同晶置换

同晶置换（Isomorphous Replacement）是X射线晶体学中解决相位问题（Phase Problem）的核心实验方法，主要用于解析生物大分子（如蛋白质、核酸）的三维结构。其核心思想是通过引入重原子（如汞、铂、铀等）制备衍生晶体，利用重原子对X射线的强散射能力确定相位信息，从而计算电子密度图并构建原子模型。以下是系统解析：

一、背景：为什么需要同晶置换？

• 相位问题：X射线衍射实验可测量衍射点的振幅（|F|），但丢失了相位（φ）信息，而重建电子密度图需同时知道振幅与相位（公式：$ \rho(x,y,z) = \frac{1}{V} \sum |F_{hkl}| e^{i\phi_{hkl}} e^{-2\pi i(hx+ky+lz)} $）。

• 解决方案：通过制备同晶重原子衍生物，利用重原子的相位贡献反推目标分子的相位。

二、方法原理与步骤

1. 制备同晶衍生物

• 关键要求：

  • 重原子仅结合在分子表面特定位点（如半胱氨酸的-SH、组氨酸的咪唑环）。

  • 衍生晶体与天然晶体高度同晶（晶胞参数差异<1%，空间群相同）。

• 常用重原子试剂：

  • Hg²⁺（结合Cys）、PtCl₄²⁻（结合Met/His）、UO₂²⁺（结合磷酸基团）。

2. 收集衍射数据

• 分别测量天然晶体（Native）和重原子衍生晶体（Derivative）的衍射强度。

• 计算结构因子振幅：$ |F_{\text{原生}}| $ 和 $ |F_{\text{衍生}}| $。

3. 定位重原子位置

• 分析差值帕特森图（Difference Patterson Map）：

  • 峰值位置对应重原子间向量（$\Delta F = |F_{\text{衍生}}| - |F_{\text{原生}}|$）。

  • 通过对称操作解析重原子坐标。

4. 计算相位

• 结构因子关系：
  $ \vec{F}{\text{衍生}} = \vec{F}{\text{原生}} + \vec{F}_{\text{重原子}}} $
  （$\vec{F}$为复数，含振幅和相位）

• 几何解法（Harker图）：
  以$\vec{F}{\text{原生}}$为未知向量，$\vec{F}{\text{衍生}}}$和$\vec{F}{\text{重原子}}}$为已知向量，通过矢量三角形确定$\vec{F}{\text{原生}}$的相位角φ。
  https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/e/e6/Isomorphous_replacement.svg/440px-Isomorphous_replacement.svg.png

5. 电子密度图计算

• 将得到的相位φ与原生晶体振幅$ |F_{\text{原生}}| $结合，计算电子密度图。

• 使用差值傅里叶图验证重原子位置并优化相位。

三、技术变体

1. 多重同晶置换（MIR）

• 原理：使用多个独立重原子衍生物，通过统计学方法提高相位精度。

• 优势：减少单衍生物误差（如重原子占位不全、非同晶性）。

• 公式：相位概率分布加权平均（Blow & Crick方法）。

2. 单波长反常散射（SAD/MAD）

• 原理：利用重原子（如硒代甲硫氨酸）对X射线的反常散射效应（$ f = f_0 + \Delta f' + i\Delta f'' $），在单一/多个波长下提取相位。

• 优势：无需制备多个衍生物，减少同晶性要求。

• 应用：现代结构生物学主流方法（如硒代蛋白晶体）。

四、成功关键与挑战

五、经典案例

1. 肌红蛋白结构（1958）

   • Kendrew首次用MIR解析（含汞、金、铂衍生物），获诺贝尔化学奖。

2. 血红蛋白（Perutz）

   • 通过铀、汞衍生物揭示氧结合构象变化。

3. 溶菌酶（1965）

   • Phillips团队解析首个酶活性中心结构（使用钯衍生物）。

六、现代替代方法

• 分子置换（Molecular Replacement, MR）：已知同源结构时直接搜索相位。

• 冷冻电镜单颗粒分析（Cryo-EM）：无需晶体，直接对单颗粒成像。

• 深度学习相位预测：如AlphaFold2直接预测蛋白结构。

七、总结：同晶置换的意义

• 历史地位：20世纪中后期结构生物学的基石，推动首个蛋白质结构解析。

• 核心价值：
  ✅ 提供实验相位（非模型依赖）。
  ✅ 适用于全新结构（无同源模板时）。

• 局限：
  ⚠️ 实验周期长（衍生筛选耗时）。
  ⚠️ 对晶体质量要求苛刻。

📚 关键记忆点：
"相位丢失困解析，重原子来破僵局；
衍生物需同晶，帕特森定重原子位；
矢量合成得相位，电子密度现真形；
若遇双解莫慌张，MIR加权精度提。"