Hayflick界限

Hayflick界限（Hayflick limit）是细胞生物学中的一个概念，指的是正常哺乳动物体细胞在体外培养条件下能够分裂的最大次数，通常约

为40至60次分裂周期。该现象最初由美国科学家伦纳德·海弗里克（Leonard Hayflick）于1961年发现。

1. 定义
   Hayflick界限指的是大多数人类体细胞在端粒长度耗尽前所能经历的有限次有丝分裂次数。在细胞每一次分裂过程中，染色体末端的端粒（telomere）会缩短；当端粒缩短到临界长度时，细胞将进入衰老状态（senescence），停止分裂。

2. 背景与发现
   在20世纪60年代之前，科学界普遍认为体外培养的哺乳动物细胞可以无限分裂。然而Hayflick通过对人类胎儿成纤维细胞的长期培养实验发现，细胞并非永生，而是在约50次分裂后停止繁殖。这一发现挑战了早期“细胞无限复制”的假设，并证实细胞老化是一种可重复观察的、内在的生物过程（¹）。

3. 机制
   Hayflick界限的根本机制与端粒缩短密切相关。端粒是位于染色体末端的重复DNA序列和相关蛋白复合体，其作用是保护染色体不被降解或融合。由于DNA复制的方向性和端粒酶（telomerase）活性的缺乏，体细胞每次复制时端粒都会变短，最终导致细胞周期阻滞、凋亡或衰老（²）。

4. 特殊情况

• 癌细胞、**胚胎干细胞（ESC）和诱导多能干细胞（iPSC）**通常能表达端粒酶，从而维持端粒长度，突破Hayflick界限而实现“无限分裂”。

• 端粒酶缺失的小鼠或人类模型显示出早发性衰老等症状。

• 人体不同组织细胞的Hayflick界限数目存在差异，例如角质形成细胞和淋巴细胞分裂次数较多（³）。

5. 生物医学意义
   Hayflick界限是细胞衰老、组织再生、癌症生物学和抗衰老研究的重要基础。它为抗癌治疗（如端粒酶抑制）、组织工程、干细胞研究提供理论依据。同时，它还为**年龄相关疾病（如心血管病、神经退行性疾病）**的机制提供关键线索（⁴）。

检测细胞的Hayflick界限（Hayflick limit）通常依赖于评估细胞分裂次数或端粒长度。以下是常见的方法和技术手段：

1. 细胞群体倍增水平（Population Doubling Level, PDL）计数
   这是最直接评估Hayflick界限的方法。每次细胞传代时，记录细胞的倍增数，直到其停止分裂。
   PDL计算公式：
   PDL = log₂（细胞总数 / 初始接种数） + 上一次PDL
   每次分裂都增加一次PDL。当PDL达到50–60左右时，正常人类体细胞通常停止分裂，进入衰老状态（senescence）。这标志着达到了Hayflick界限。

2. 端粒长度检测（Telomere Length Assay）
   由于端粒缩短是Hayflick界限的根本机制，因此测量端粒长度是间接评估其状态的主要手段。常见技术包括：

 a. Southern Blot（端粒酶限制片段长度分析, TRF analysis）
  - 将基因组DNA酶切后杂交检测端粒区域长度
  - 分辨率高，但操作繁琐、耗时

 b. 实时定量PCR（qPCR）
  - 测量端粒重复序列相对丰度（T/S比值：telomere/single copy gene）
  - 快速、低成本，但精度不如Southern blot

 c. 荧光原位杂交（FISH）
  - 特别是Q-FISH（Quantitative FISH）和Flow-FISH（流式细胞仪结合FISH）
  - 适用于单个细胞端粒长度的测定，常用于临床样本或肿瘤研究

 d. 全基因组测序端粒分析（WGS-based Telomere Length Estimation）
  - 基于高通量测序计算端粒序列比重
  - 目前主要用于研究级别，临床尚不常用

3. 衰老相关标志物检测
   虽然不是直接评估分裂次数，但以下方法可反映细胞是否达到分裂极限：
    - SA-β-Gal染色（Senescence-Associated β-galactosidase）
    - p16^INK4a、p21、p53等衰老相关通路蛋白的表达
    - γ-H2AX阳性核斑点（DNA损伤标志）
    这些标志物常与端粒危机或Hayflick极限有关。

4. 端粒酶活性检测（Telomerase Activity Assay）
    - TRAP法（Telomeric Repeat Amplification Protocol）
     可检测端粒酶（telomerase）是否活跃。正常体细胞中该酶活性低或无活性。若存在端粒酶活性，则可能尚未达到Hayflick界限或为某种“逃避衰老”的细胞（如癌细胞）。

6. 相关新闻

1961年， Hayflick和Moorhead报道，体外培养的人二倍体细胞表现出明显的衰老、退化和死亡的过程。若 将细胞数以1∶2的比率(即一瓶细胞分为两瓶细胞)连续进行传代(群体倍增)，则平均只能传代40～60次，此后细胞就逐渐解体并死亡。这个发现很快就得 到许多研究者的证实。他们的工作表明：细胞，至少是培养的细胞，不是不死的，而是有一定的寿命的；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就是著 名的Hayflick界限。此外，Hayflick等还发现，从胎儿肺得到的成纤维细胞可在体外条件下传代50次，而从成人肺得到的成纤维细胞只能传代 20次，可见细胞的增殖能力与供体的年龄有关。这一现象也为许多研究者所证实。Hayflick还比较了取自寿命长度不同的生物的胚成纤维细胞在体外培养 条件下的传代次数和寿命的关系，发现物种寿命与培养细胞寿命之间存在着确定的相互关系，例如取自龟的培养细胞传代次数达90～125次，而来自小鼠的细胞 在体外的传代次数只有14～28次。 

    为了确定体外培养的人二倍体细胞的衰老是细胞本身决定的还是由于培养环境的恶化(例如培养 基中营养物质的缺乏，细菌的污染或有毒物质的积累)造成的，Hayflick设计了巧妙的实验，他以间期有无巴氏小体作为供体细胞的标记，将取自老年男性 个体的细胞(间期无巴氏小体)和取自年轻女性个体的细胞(间期可见巴氏小体)进行单独或混合培养，并统计其倍增次数。结果混合培养中的两类细胞的倍增次数 与各自单独培养时相同，即在同一培养基中，当年轻细胞旺盛增殖的同时，年老细胞就停止生长了。这一结果有力地说明，巴氏小体的污染并没有影响细胞的衰老， 决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不是外部的环境。为了进一步探索体外培养的二倍体细胞衰老表达的控制机理， Wright和 Hayflick用松胞素 B处理细胞，然后离心除去细胞核，得到细胞质体(cytoplast)，再用细胞质体与完整细胞进行杂交，观察杂种细胞衰老的表现。结果发现，年轻的细胞 质体与年老的完整细胞融合时，得到的杂种细胞不能分裂；而年老的细胞质体与年轻的完整细胞融合时，杂种细胞的分裂能力与年轻细胞几乎相同。这一实验的结果 说明，是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老的表现。至此，Hayflick界限，即关于细胞的增殖能力和寿命是有限的观点，为广大的研究者所接受。当我们 叙述到这里时，会很自然地提出这样的问题，有些细胞在体外传代而发生转型(癌化)，并形成细胞系，它们可以在体外无限传代，这些细胞多数为非整倍性或亚二 倍性，其染色体组型与遗传性发生了变化，与二倍体细胞是根本不一样的，它们在培养时完全失去了接触抑制，所以完全不受Hayflick界限规律的支配。

参考文献：
(¹) Hayflick L, Moorhead PS. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res. 1961.
(²) Blackburn EH. Switching and signaling at the telomere. Cell. 2001.
(³) Shay JW, Wright WE. Hayflick, his limit, and cellular ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 2000.
(⁴) Campisi J, d’Adda di Fagagna F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007.