免疫组化

免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术（immunohistochemistry）或免疫细胞化学技术（immunocytochemistry）。

众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。免疫荧光法是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一，包括荧光抗体和荧光抗原技术，具有抗原抗体反应的特异性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏性等优势。但是，由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜，荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定限制，而逐渐被免疫酶法所取代。

• 18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉
• 水浴锅

• PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。
• 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。
• 0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0，加水至1000ml。
• 1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121g Tris碱，用1N的HCl调至pH8.0，加水至1000ml。
• 酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1% CaCl2(pH7.8)配制。b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
• 3%甲醇-H2O2溶液：用30% H2O2和80%甲醇溶液配制。
• 封裱剂：a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；b、油和TBS(或PBS)配制。
• TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。

脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

1. 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；
2. 无水乙醇中浸泡5分钟；
3. 95%乙醇中浸泡5分钟；
4. 70%乙醇中浸泡5分钟；

用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。

• 抗原热修复
  • （1）高压热修复：在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
  • （2）煮沸热修复：电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。
  • （3）微波热修复：在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
• 酶消化方法：常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。

1. 脱蜡、水化；
2. PBS洗2～3次各5分钟；
3. 3% H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；
4. PBS洗2～3次各5分钟；
5. 抗原修复；
6. PBS洗2～3次各5分钟；
7. 滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。
8. 滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
9. 4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
10. PBS洗3次各5分钟；
11. 滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；
12. II抗中可加入0.05%的tween-20。
13. PBS洗3次各5分钟；
14. DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；
15. PBS或自来水冲洗10分钟；
16. 苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
17. 自来水冲洗10～15分钟；
18. 脱水、透明、封片、镜检。

1. 脱蜡、水化。
2. PBS洗两次各5分钟。
3. 用蒸馏水或PBS配置新鲜的3% H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。
4. 抗原修复。
5. PBS洗5分钟。
6. 滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。
7. 滴加Ⅰ抗，室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。
8. PBS洗三次每次2分钟。
9. 滴加生物素化二抗，20℃～37℃20分钟。
10. PBC洗3次每次2分钟。
11. 滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。
12. PBS洗4次每次5分钟。
13. DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。
14. 蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。
15. 脱水、透明、封片、镜检。

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• 金伯泉. 细胞和分子免疫学. 2版. 北京: 科学出版社; 2003.
• 王伯沄, 李玉松, 黄高昇, 等. 病理学技术. 北京: 人民卫生出版社; 2000.