冷冻电镜

冷冻电镜（cryo-EM）全称为冷冻电子显微镜技术，起源于20世纪70至80年代。该技术利用低温环境（通常为-196°C液氮温度）与透射电子显微镜结合，观察生物样品的精细结构。其核心在于将生物分子快速冷冻在非晶态（玻璃态）冰中，从而保持其天然构象，避免传统固定、染色或结晶过程中可能出现的伪影。

冷冻电镜与X射线晶体学（X-ray crystallography）和核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）并称为高分辨率结构生物学的三大方法。与后两者相比，冷冻电镜不需要蛋白质结晶，且可处理分子量巨大的复合物或处于动态变化的样品。

早期探索（1960s-1980s）

1968年，Aron Klug在剑桥MRC分子生物学实验室开创了电子显微镜三维重构方法，奠定了冷冻电镜的算法基础，并因此获得1982年诺贝尔化学奖。1970年代，Richard Henderson成功解析了细菌视紫红质（bacteriorhodopsin）的低分辨率结构，首次证明电镜可用于膜蛋白结构研究。1980年代，Jacques Dubochet开发了快速冷冻技术，将含水样品瞬间冷却至玻璃态，避免了冰晶对结构的破坏。同时，Joachim Frank发展了单颗粒图像处理算法，包括二维对齐和三维重构的数学框架。

技术突破（1990s-2010s）

2000年代，直接电子探测器（direct electron detector）的出现彻底改变了冷冻电镜领域。与传统探测器件相比，直接电子探测器具有更高的量子效率和信噪比，并能以电影模式记录图像，从而校正电子束引起的样品移动（beam-induced motion），极大提升了分辨率。2013年，加州大学旧金山分校的程亦凡与David Julius团队利用冷冻电镜解析了TRPV1离子通道的近原子分辨率结构，标志着“分辨率革命”的启动。此后，冷冻电镜迅速成为结构生物学的主流工具。

诺贝尔奖与当前发展

2017年，诺贝尔化学奖授予Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson，以表彰他们在冷冻电镜技术发展中的开创性贡献。当前，冷冻电镜已可用于解析小于100 kDa的蛋白质结构，并通过相位板（volta phase plate）和冷冻电子断层扫描（cryo-electron tomography）技术，扩展到细胞原位结构研究。

样品制备

样品制备是冷冻电镜成功的关键。通常，将纯化的蛋白质溶液滴在载网（如碳膜或金网）上，用滤纸吸去多余液体，形成薄层（约100 nm），然后迅速投入液氮冷却的乙烷中，降温速率可达每秒10^5-10^6°C，使水分子来不及结晶而形成玻璃态。此过程保护了生物分子的天然结构。若冷冻缓慢，冰晶会损伤样品并导致低分辨率。

数据采集

在透射电子显微镜中，电子束以极低剂量（通常<20 e⁻/Ų）辐照样品，以减少辐射损伤。直接电子探测器以电影模式记录一系列图像，每张图像为短时间曝光，然后通过算法校正样品漂移和剂量加权。采集的数据包含数千至数百万张粒子图像，需进行筛选和预处理。

图像处理与三维重构

单颗粒分析（single-particle analysis）是重建三维结构的标准方法。主要步骤包括：

• 粒子挑选（automatic or manual particle picking）
• 二维分类（2D classification）去除噪声和异质性
• 初始模型构建（initial model generation）
• 三维分类（3D classification）区分不同构象
• 高分辨率精修（high-resolution refinement）
• 分辨率评估（FSC曲线）和局部分辨率优化

最终得到的三维密度图可以用于原子模型搭建，揭示蛋白质的精细结构。

冷冻电镜的优势在于避免结晶，适合难以结晶的膜蛋白和大型复合物，且能观察样品的多种构象。局限性包括：需要高浓度样品、辐射损伤、冰层厚度不均、以及对于小分子量样品的难度仍较高。

结构生物学

冷冻电镜已成功解析了大量重要生物大分子的结构，如核糖体、剪接体、蛋白酶体、离子通道（如TRPV1、Nav、Kv）、G蛋白偶联受体（GPCRs）等。这些结构为理解分子机制和药物设计提供了基础。

药物发现

基于结构的药物设计（SBDD）依赖于高分辨率结构。冷冻电镜可直接观察药物-靶点复合物的结合细节，缩短先导化合物优化周期。例如，针对新冠病毒主蛋白酶（Mpro）和刺突蛋白（Spike）的冷冻电镜结构，为疫苗和抗病毒药物研发提供了关键信息。

细胞原位结构

冷冻电子断层扫描（cryo-ET）结合冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）减薄，可直接在细胞片层中观察细胞器、病毒颗粒及蛋白质复合物的原位结构，揭示其在生理环境中的组织方式。

冷冻电镜技术仍在快速发展。新型探测器（如CMOS）、更高效的相位板、自动化数据采集和人工智能辅助图像处理（如基于深度学习的分辨率提升和粒子挑选）将进一步降低门槛，提高分辨率。此外，时间分辨冷冻电镜（time-resolved cryo-EM）和原位结构解析有望揭示生物过程的动态机制。冷冻电镜正从结构生物学拓展到化学、材料科学乃至纳米技术领域。

（图注：冷冻电镜数据采集与处理流程示意图）

（图注：冷冻电镜三维重构原理示意）

• Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. J., Homo, J. C., Lepault, J., McDowall, A. W., & Schultz, P. (1988). Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics, 21(2), 129-228.
• Frank, J. (2016). Three-dimensional electron microscopy of macromolecular assemblies: Visualization of biological molecules in their native state. Oxford University Press.
• Henderson, R. (1995). The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics, 28(2), 171-193.
• Cheng, Y. (2018). Single-particle cryo-EM at crystallographic resolution. Cell, 173(5), 1121-1130.
• Bai, X. C., McMullan, G., & Scheres, S. H. W. (2015). How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends in Biochemical Sciences, 40(1), 49-57.
• Nogales, E., & Scheres, S. H. W. (2015). Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 16(2), 120-130.