FRET

FRET（Förster Resonance Energy Transfer）是一种基于能量共振转移的技术，用于研究分子间相互作用、构象变化和距离测量。FRET技术在生物化学、细胞生物学和生物物理学中具有广泛应用。以下是关于FRET的详细信息：

1. 基本原理

   - 能量转移：FRET是一种非辐射能量转移现象，当供体荧光团（donor）被激发后，通过偶极-偶极相互作用将能量转移给邻近的受体荧光团（acceptor），导致受体荧光团发光。

   - 距离依赖：FRET效率（E）与供体和受体之间的距离（r）呈强烈的距离依赖关系，FRET效率与r⁶成反比。当距离在1-10纳米范围内时，FRET最有效。

   - Förster距离（R₀）：供体和受体之间的特征距离，在该距离下FRET效率为50%。

2. FRET效率计算

3. 常用FRET对

   - 荧光蛋白对：如CFP（青色荧光蛋白）和YFP（黄色荧光蛋白），GFP（绿色荧光蛋白）和RFP（红色荧光蛋白）。

   - 小分子荧光染料对：如FITC（荧光素异硫氰酸酯）和TRITC（四甲基罗丹明异硫氰酸酯）。

4. 应用

   - 分子间相互作用：FRET用于检测和分析蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、核酸-核酸之间的相互作用。

   - 构象变化：通过标记分子的不同部位，研究分子的构象变化和动力学。

   - 距离测量：测量生物分子间的纳米级距离变化，如受体配体结合、蛋白质复合物组装等。

   - 细胞内过程监测：实时监测细胞内信号传导、蛋白质定位和动力学变化。

5. 实验方法

   - 荧光显微镜：共聚焦显微镜、宽场荧光显微镜或TIRF显微镜用于FRET检测。

   - 光谱分析：使用荧光光谱仪测量供体和受体的荧光强度。

   - 荧光寿命成像显微镜（FLIM）：通过测量供体的荧光寿命变化来计算FRET效率。

6. 数据分析

   - FRET效率（E）：通过供体和受体的荧光强度变化、荧光寿命变化计算。

   - FRET比值法：通过计算受体荧光强度与供体荧光强度的比值，定量分析FRET效率。

   - FLIM-FRET：通过供体荧光寿命的变化直接计算FRET效率，提供更加准确的测量。

7. 优势和局限性

   - 优势：FRET可以在活细胞中实时、定量地研究生物分子相互作用，灵敏度高，空间分辨率高。

   - 局限性：需要精确的荧光标记，荧光团光漂白、光毒性等可能影响实验结果，数据分析复杂。

8. 示例实验

   - 蛋白质相互作用研究：使用CFP标记蛋白A，YFP标记蛋白B，通过FRET检测两者的相互作用。

   - 细胞内钙浓度检测：利用钙指示器（如Fura-2）的FRET效应，实时监测细胞内钙浓度变化。

   - 构象变化分析：在蛋白质的两个不同部位标记供体和受体荧光团，通过FRET分析构象变化。

参考文献：

1. Lakowicz, J. R. (2006). Principles of Fluorescence Spectroscopy (3rd ed.). Springer.

2. Förster, T. (1948). Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annalen der Physik, 437(1-2), 55-75.

3. Jares-Erijman, E. A., & Jovin, T. M. (2003). FRET imaging. Nature Biotechnology, 21(11), 1387-1395.

4. Piston, D. W., & Kremers, G. J. (2007). Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences, 32(9), 407-414.

5. Sekar, R. B., & Periasamy, A. (2003). Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. Journal of Cell Biology, 160(5), 629-633.