钙成像

钙成像（Calcium Imaging）是一种用于实时检测和测量细胞内钙离子（Ca²⁺）浓度变化的技术。钙成像广泛应用于研究神经元活动、肌肉收缩、信号传导和细胞生理等领域。以下是关于钙成像的详细信息，包括实验原理、方法、应用和注意事项。

1. 实验原理

钙成像利用钙指示剂（Calcium Indicators）在与钙离子结合时荧光特性发生变化的原理，检测细胞内钙离子浓度的动态变化。钙指示剂可以是荧光染料或基因编码的荧光蛋白。

2. 常用钙指示剂

荧光染料

- Fura-2：双波长比率法检测钙浓度变化，340 nm和380 nm激发光下荧光强度比值与钙浓度相关。

- Fluo-4：单波长激发（488 nm），钙结合后发射绿色荧光，适用于高通量筛选和实时成像。

- Rhod-2：单波长激发（552 nm），钙结合后发射红色荧光，适用于厚组织或活体成像。

基因编码钙指示剂

- GCaMP系列：基于绿色荧光蛋白（GFP）和钙调蛋白（Calmodulin）设计的钙指示剂，钙结合后荧光增强。

- RCaMP系列：基于红色荧光蛋白（RFP）和钙调蛋白设计的钙指示剂，钙结合后荧光增强。

3. 实验步骤

细胞或组织准备

1. 培养细胞：在培养皿或玻片上培养待测细胞，如神经元、心肌细胞或其它细胞系。

2. 组织切片：准备新鲜组织切片，如脑片或心脏组织切片。

加载钙指示剂

1. 荧光染料加载：

   - 准备指示剂工作液：如Fura-2 AM、Fluo-4 AM溶于DMSO，并加入Pluronic F-127帮助细胞渗透。

   - 加入指示剂工作液：将工作液加入细胞或组织培养基中，37°C孵育30-60分钟。

   - 洗涤：用适当的缓冲液（如HBSS）多次洗涤，去除未结合的指示剂。

2. 基因编码指示剂：

   - 细胞转染：使用病毒载体或电穿孔法将编码GCaMP或RCaMP的基因导入细胞。

   - 表达和观察：等待基因表达，并通过荧光显微镜观察钙指示剂的表达。

荧光成像

1. 显微镜选择：根据实验需求选择共聚焦显微镜、宽场荧光显微镜或荧光寿命显微镜（FLIM）。

2. 激发和发射波长选择：根据钙指示剂的特性选择合适的激发和发射波长。

3. 实时成像：实时记录荧光强度变化，观察钙信号动态。

4. 数据分析

1. 荧光强度分析：使用图像分析软件（如ImageJ）分析荧光强度随时间的变化。

2. 比率成像：对于双波长指示剂（如Fura-2），计算荧光强度比值，定量钙浓度变化。

3. 荧光寿命成像（FLIM）：测量荧光寿命变化，更加准确地反映钙浓度变化。

5. 应用

- 神经元活动研究：检测神经元在刺激、药物处理或电生理操作下的钙信号变化，研究神经元兴奋和突触传递。

- 心肌细胞研究：观察心肌细胞的钙波和钙瞬变，研究心肌收缩和心脏功能。

- 细胞信号传导：研究不同信号分子（如激素、神经递质）诱导的钙信号变化，揭示信号传导机制。

- 高通量药物筛选：评估化合物对细胞内钙浓度的影响，用于药物发现和开发。

6. 注意事项

- 指示剂选择：根据实验需求选择合适的钙指示剂，考虑其光谱特性、钙结合亲和力和细胞渗透性。

- 细胞健康：确保细胞在加载指示剂和检测过程中的健康状态，避免细胞应激或损伤。

- 实验条件控制：控制实验条件（如温度、pH），避免对钙信号的干扰。

- 光漂白和光毒性：减少激光或光源的强度和照射时间，避免荧光指示剂的光漂白和光毒性对细胞的影响。

7. 实验示例

- 神经元钙信号检测：在培养的神经元上加载Fluo-4，通过电刺激或化学刺激诱导钙信号变化，使用共聚焦显微镜实时记录。

- 心肌细胞钙波成像：在培养的心肌细胞上加载Rhod-2，通过激光扫描共聚焦显微镜观察心肌细胞的钙波传播。

参考文献

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