酵母双杂交系统

1. **简介**  

酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system, Y2H）是一种用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的分子生物学技术。该系统利用酵母的转录机制，通过报告基因表达来检测两种蛋白质之间的相互作用。自20世纪80年代末开发以来，酵母双杂交系统已成为研究蛋白质相互作用网络的主要方法之一。

2. **基本原理**  

酵母双杂交系统基于转录因子功能的重构。典型的转录因子具有两个独立的功能域：DNA结合域（DNA-binding domain, BD）和转录激活域（activation domain, AD）。在酵母双杂交系统中，这两个功能域分别与待测的两个蛋白质融合，如果这两个蛋白质相互作用，BD和AD会重新组合在一起，激活下游报告基因的表达，从而检测到蛋白质相互作用。

3. **实验步骤**  

酵母双杂交系统的实验步骤主要包括以下几个部分：

    1. **构建融合蛋白**：将感兴趣的两个蛋白质基因分别克隆到带有BD和AD的表达载体中，构建成融合蛋白。

    2. **转化酵母**：将含有融合蛋白表达载体的质粒转化到酵母细胞中，通常使用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为宿主细胞。

    3. **筛选和报告基因检测**：转化后的酵母细胞在选择性培养基上生长，如果目标蛋白质之间存在相互作用，BD和AD重新组合，激活报告基因（如HIS3、ADE2或LacZ）的表达。通过培养基筛选或报告基因的活性检测，可以判断蛋白质相互作用的存在。

4. **优点和局限性**  

酵母双杂交系统具有许多优点，但也存在一些局限性：

    1. **优点**：

        - **高通量筛选**：能够同时筛选大量蛋白质相互作用，对复杂的蛋白质网络研究特别有用。

        - **灵敏度高**：能够检测到低亲和力的蛋白质相互作用。

        - **操作简便**：实验步骤相对简单，结果易于解读。

    2. **局限性**：

        - **细胞环境差异**：酵母细胞环境与高等真核细胞不同，某些蛋白质相互作用可能不在酵母中发生。

        - **假阳性和假阴性**：可能会产生非特异性相互作用（假阳性）或由于蛋白质折叠问题而未检测到真实相互作用（假阴性）。

        - **蛋白质表达**：某些蛋白质在酵母中可能无法正确表达或折叠，影响实验结果。

5. **应用**  

酵母双杂交系统广泛应用于蛋白质相互作用的研究，包括：

    1. **蛋白质网络构建**：系统性筛选蛋白质相互作用，构建复杂的蛋白质相互作用网络。

    2. **信号通路研究**：研究特定信号通路中的蛋白质相互作用，揭示信号传导机制。

    3. **药物靶点发现**：通过识别与疾病相关的蛋白质相互作用，发现潜在的药物靶点。

    4. **功能域分析**：通过研究蛋白质的相互作用，确定功能域及其在相互作用中的作用。

6. **参考文献**  

    1. Fields, S., & Song, O. (1989). A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 340(6230), 245-246.

    2. Uetz, P., Giot, L., Cagney, G., Mansfield, T. A., Judson, R. S., Knight, J. R., ... & Rothberg, J. M. (2000). A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature, 403(6770), 623-627.

    3. Ito, T., Chiba, T., Ozawa, R., Yoshida, M., Hattori, M., & Sakaki, Y. (2001). A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proceedings of the National Academy of Sciences, 98(8), 4569-4574.

    4. Suter, B., & Kittanakom, S. (2012). Yeast two-hybrid technologies. Encyclopedia of Life Sciences (ELS). John Wiley & Sons, Ltd.

    5. Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., & Van Dijck, P. (2012). Diversity in genetic in vivo methods for protein–protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 76(2), 331-382.