DNA重组

在细菌中，进入细胞的DNA片段可成为主染色体的一部分或成为一个质粒。这个整合过程称为基因重组（genetic recombination）；一般它发生在两个DNA完全相同或非常接近的位置上。对于一个物种，重组可为一个有益的过和，因为它可形成新的遗传信息。群体中形成的所有新基因和等位基因不仅源于突变，也源于某种类型的重组事件。新基因和新的等位基因可使得一个群体在不利的或变化的环境条件中继续生存。此外，DNA的吸收和基因重组可以给有机体提供一个机制，使其可替换被严重损伤的或被删除的基因。
在真核生物中，基因重组可在有性繁殖的后代中形成遗传的多样性。在减数分裂的过程中，交换过程可在配子中产生与亲代不同的连锁排列。有利的基因重组通过自然选择可成为永久性的。发生在减数分裂过程中的重组也意味着DNA的修复和丢失DNA的补充。修复是通过对与损伤或丢失DNA相似的外源DNA进行拷贝而实现的。由于有大量的催化重组的遗传系统，所以。重组过程也各不相同。

位点特异重组（site，specific recombination）在重组的DNA分子之间只需短的同源性序列。通常它可改变染色体片段的相对位置。如果带有相同的双链区域（称为重组位点），在不同染色体之间的重组就可发生。基于特异的重组位点至少有四种类型的重组[1. 依赖限制件内切核酸酶位点（RES）；2. 依赖插入序列（IS）；3. 依赖长末端重复序列（LTR）和Dclta重复序列（DR）4. 依赖信号序列（ss）]。这些重组是基于下列方面：限制性内切核酸酶忙点（RES）、捕人序列（IS）、长末端重复序列（LTR）和信号序列（SS）：在细菌与病毒基因组之间的重组（基于限制性内切核酸酶位点）和在原核质粒与它们的细菌宿主之间的重组（基于IS）。

非特异重组（general recombination）只发生在同源DNA分子之间，通常它不改变各自染色体内的基因位置。非特异重组只有一种类型：依赖同源区域（HR）。

一、原核生物中的非特异重组（非位点依赖性重组，见图1）
在细菌和其他有机体中一种常见的重组类型是在两个同源染色体之间或同一染色体中DNA片段和同源区域之间的重组。因为这类重组不需要“特殊"位点，所以，它被称为非特异重组或非

图1 非特异重组(非位点依赖性重组)。(a)在细菌中，正在转化的DNA以单链分子的形式进入细胞，RecA蛋白与单链DNA结合．后来，ReeA蛋白与细苗染色体结合并随着它寻找同源性区域，把双螺旋解链。在转化的DNA和细胞DNA互补区域之间形成氢键。一个酶(如UvrABc)切除解链的DNA的非配对部分。连接酶修复切口。如果两条新链不完全同源，将会有小的扭曲变形，这些可被DNA修复系统所矫正。修复过程除去一条非同源链。在此例中，最初的DNA链丢失。(b)在细菌中．通常接合发生在受体细胞的双链分子中。RecBCD蛋白寻找DNA上的一个‘chi(χ)位点，在此它切断一条DNA链(形成—个‘切口’)。产生的单链DNA与RecA蛋白结合。RecA蛋白与细菌染色体结合，随着它寻找同源性区域，使双链解链。导致与新DNA组合的步骤与(a)部分讨论的完全相同。

位点依赖性重组（general recombination or site-independent recombination）。它需要DNA之间广泛的同源性，并且与DNA合成有关。许多细菌中的非位点依赖性重组依赖于rec基因（recA、recB、recC、recD）的产物。
如果DNA片段是单链，RecA蛋白（RecA protein）与它结合并引导它到细胞染色体上的同源区域RecA蛋白在细胞染色休与该片段同源区域进行解链，并促进在该片段与一条染色体DNA链之问形成氢键。成功进行非特异重组所需最少的同源核苷酸碱基数量约为60个碱基对，但通常有数百个碱基。最后，UvrABC限制性内切核酸酶（UvrABC endonuelease）从该染色体上切除已解开的多余的链。连接酶修复切口。如果有错误，UvrABC在错配链的两端做切口，修复酶（DNA聚合酶I）把错配的链移走并用与互补链相配的新DNA替代。连接酶修复DNA中的切口。由于链的交换，一个新的等位基因经常置换原有的基因。这可导致细胞特征的改变，这种现象称为转型（transformation）。
如果DNA片段是双链，在重组发生之前它必须被转换为单涟DNA。从片段的一个末端起始，RecBCD蛋白行进到chi（χ）位点，在此Rect3CD的RecD亚单位切断DNA的一条链。然后，RecA蛋白与该单链DNA结合，然后再结合到细胞染色体的一个同源区域。该单链DNA与同源染色体DNA形成氢键，并成为这个染色体的一部分。

图2 非特异重组和Holliday中间体(chi或χ型)的形成。(a)两个同源染色单体联会；(b)每个同源染色单体的一条链被切断并被交换；(c)DN A合成可延仲已交换的链，以至DNA切口修复。上面的染色单体旋转180度形成Holliday中间体；(d)酶复合物RuvAB可促进分支移位，致使未切断的链被限制性内切核酸酶RuvC以在四核苷酸序列5'-(A/T)TT(G/C)-3'处切断口这就是Holliday中间体；(e)染色单体未断链的切开形成了分开的重组染色单体。重组染色单体中的切口被连接酶修复。

二、真核生物中的非特异重组（见图2）
非特异重组通常发生在减数分裂的前期Ⅰ。在前期Ⅰ中有五个阶段：它们是（顺序是从最早的阶段到最晚的阶段）细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期。在细线期阶段，染色体开始凝聚为成环的螺线管形式，但是，在光学显微镜下还见不到它。偶线期中在同源染色体对之问的许多医域阶梯样蛋白质开始形成的时候，同源染色体形成配对。这个结构约为100nm宽，它被称为联会复合体（synaptonemal complex）。被称为重组节（recombination module）（直径约90nm）的非常大的蛋白质存在于联会复合体的间隙中，它作为多酶的“重组机器”在起作用。在每个重组节，四个染色单体中的两个断裂并各自分别与另外一个再结合，这种现象称为交换（crossing over）。 在前期工的粗线期（pachytene stage），染色体浓缩，联会复合体开始降解。去联会（desynapsis）标志着双线期（diplotene stagey）的开始。在双线期交叉首次显现。交叉（chiasmata）是同源染色体“交义形结构连在一起的区域。在每个交叉位点上的纠缠在一起的重组染色单体的功能是把父系和母系同源染色体共同结合在纺锤体上，一直持续到后期Ⅰ。关于联会复合体的蛋白质分子，重组节，以及导致同源染色体片段联会的机制等，知之甚少。一般认为，重组节中的限制性内切核酸酶切断每个能重组的染色单体的一条单链，解旋酶使DNA解旋，形成单链区域。一个与RecA相似的蛋白质催化单链DNA与同源染色单体上的互补链配对。DNA聚合酶可延伸已交换的链，DNA连接酶除去链中的切口。这个阶段的DNA已从大肠杆菌中分离出来，并称其为chi（χ）型，或以在1984年提出这个模型的科学家的名字命名为Holliday中间体（Holliday intermediate）．或Holliday连接（HolIiday juriction）。chi型可通过一个限制性内切核酸酶裂解每个染色单体中未切断的链转换为两个线性的DNA分子。产生的DNA分子相互重组。RuvC限制性内切核酸酶在特殊的四核苷酸序列5’-（A/T）TT（G/C）-3’的T和（G/C）之间切断。如果在HoLliday连接处役有合适的四核苷酸序列，RuvAB蛋白复合物可促进Holliday连接移动到含有可被RuvC剪切的染色体的四核苷酸序列区域。

外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口（图1.8），当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌ＤＮＡ连接酶和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶。实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶都是首选的用酶。这是因为在下述反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。
　　ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。在加作用的底物。如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。这样，在ＤＮＡ浓度低时，质粒ＤＮＡ重新环化将卓有成效。如果连接反应中ＤＮＡ浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性也有所增大。因此在ＤＮＡ浓度高时，连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。Dugaiczyk等(1975;同时参见Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第２、３期合刊）从理论上探讨了ＤＮＡ浓度对连接产物性质的影响。简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：j和i。j是ＤＮＡ分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，j的数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的ＤＮＡ呈随机卷曲。这样，j与ＤＮＡ分子的长度成反比（因为ＤＮＡ越长，某一给定分子的两末端的越不可能相互作用），因此j对给定长度的ＤＮＡ分子来说是一个常数，与ＤＮＡ深度无关。j＝【3/(3πlb0)】3/2其中l是ＤＮＡ长度，以cm计，b是随机卷曲的ＤＮＡ区段的长度。b的值以缓冲液的离子强度为转移，而后者可影响ＤＮＡ的刚度。
i是溶液中所有互补末端的深度的测量值，对于具有自身互补粘端的双链dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml这里Ｎo是阿佛伽德罗常数，Ｍ是ＤＮＡ的摩尔浓度（单位：mol/L)。理论上，当j=i时，给定ＤＮＡ分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。因而在这样的条件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。而当j>i时，有利于重新环化；当i>j，则有利于产生多联体。图1.9显示了ＤＮＡ区段的大小与连接反应混合物中j:i之比分别为0.5、1、2和5时所需ＤＮＡ浓度之间关系（Ｄugaiczyk等，1985）。现在考虑如下的连接反应混合物：其中除线状质粒之外，还含有带匹配末端的外源ＤＮＡ片段。对于一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组基因组的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响，而且还受质粒和外源ＤＮＡ末端的相对浓度的影响。当i是j的２－３倍（即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时）外源ＤＮＡ末端浓度的２倍时，有效重组体的产量可达到最大。这些条什下，连接反应终产物的大约40％都是由单体质粒与外源ＤＮＡ所形成的嵌合体。当连接混合物中线性质粒的量恒定（j:i=3）而带匹配末端的外源ＤＮＡ的量递增时，这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。
涉及带粘端的线状磷酸化质粒ＤＮＡ的连接反应应包含：
１）足量的载体ＤＮＡ，以满足j:i>1和j:i<3。对一个职pUC18一般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体ＤＮＡ为20-60μg/ml。
２）未端浓度等于或稍高于载体ＤＮＡ的外源ＤＮＡ，如外源ＤＮＡ浓度比载体低得多，在效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒ＤＮＡ或发迹克隆策略以便通过定向克隆的方法构建重组质粒。

１）用适当的限制酶消化质粒和外源ＤＮＡ。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒ＤＮＡ。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化ＤＮＡ，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。
２）按如下所述设立连接反应混合物：
a．将0.1μl载体ＤＮＡ转移到无菌微量离心管中，加等摩尔量的外源ＤＮＡ。
b．加水至7.5μl，于45℃加温５分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到０℃。
c．加入：10xT4噬菌体ＤＮＡ连接酶缓冲液 １μl
    Ｔ４噬菌体ＮＤＡ连接酶 0.1Weiss单位
    ５mmol/L ATP 1μl
于16℃温育１－４小时

    10xT4噬菌体ＤＮＡ连接酶缓冲液
    200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)
    50mmol/K MgCl2
    50mmol/L二硫苏糖醇
    500μg/ml牛血清白蛋白（组分Ｖ.Sigma产品）（可用可不用）
该缓训液应分装成小份，贮存于－20℃。
另外，再设立两个对照反应，其中含有（１）只有质粒载体；（２）只有外源ＤＮＡ片段。如果外源ＤＮＡ量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒ＤＮＡ，并尽可能多加外源ＤＮＡ，同时保持连接反应体积不超过10μl。可用至少３种不同方法来测定Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶的活性。大多数制造厂商（除New England Biolabs公司外）现在都用Weiss等，１1968)对该酶进行标化。１个Weiss单位是指在37℃下20分钏内催化１mmol32P从焦磷酸根置换到【γ,β-32P】ATP所需酶时，１个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位（Modrich和Lehman,1970)或者60个粘端单位（如Ｎew England Biolabs公司所定义）。因此，0.015Ｗeiss单位的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶在16℃下30分钟内可使50％的λ噬菌体HindⅢ片段（5μg）得以连接。在本书中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶一律用Weiss单位表示。par 目前提供的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶均为浓溶液（1-5单位/μl），可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫苏糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50％甘稀释成100单位/ml的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的Ｔ４噬体ＤＮＡ连接酶于-20℃保存３个月可保持稳定。
３）每个样品各取１－２μl转化大肠杆菌感受态细胞。

Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶不同于大肠杆菌ＤＮＡ连接酶，它可以催化平端ＤＮＡ片段的连接（Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由于ＤＮＡ很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何ＤＮＡ分子彼此相连。然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下４个条件：
１）低浓度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。
２）不存在亚精胺一类的多胺。
３）极高浓度的连接酶（50Weiss单位．ml）。
４）高浓度的平端。
１．凝聚剂
在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致ＤＮＡ分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Ｈarrison,1985)或氯化六氨全高钴（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得适当浓度的平端ＤＮＡ的总是迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用：
１）它们可使平端ＤＮＡ的连接速率加大１－３个数量级，因此可使连接反应在酶ＤＮＡ浓度不高的条件下进行。
２）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的ＤＮＡ浓度下，所有的ＤＮＡ产物也将是线状多聚体。par 在设立含凝聚剂的连接反应时，下列资料可供参考。
（１）聚乙二醇（PEG8000）
１）用去离子水配制的ＰＥＧ8000贮存液（40％）分装成小份，冰冻保存，但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含15％PEG 8000的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显著。除PEG 800和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于０℃混合，然后加适当体积的PEG 8000（处于室温），混匀，加酶后于20℃进行温育。
２）连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至ATP浓度略有增加或ＭgCl2浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。
３）浓度为15％的PEG 8000可刺激带粘端的ＤＮＡ分子的连接效率提高至原来的10-100倍，反应的主产物是串联的多联体。
４）PEG 8000可刺激短至８个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六氨合高钴有所不同。
（２）氯化六氨合高钴
１）氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20℃，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5μmol/L时，其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部，但只能使端连接的效率提高到原来的５倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。
２）在单价阳离子（30mmol/L KCl）存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变。连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状ＤＮＡ将点尽优势。
３）与ＰＥＧ 8000不同，氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。

质粒克隆中最慢的步骤是所需的外源ＤＮＡ片段和相应质粒ＤＮＡ区段的电泳纯化，下面的操作方案【由S.Michaelis(个人通讯）根据Struhl(1985)的方法修订而成】是从纯化的凝胶中回收琼脂糖块，熔化后直接进行质粒和外源ＤＮＡ的连接。这一方法寻平端连接和粘端连接都同样奏效，但需大量的连接酶，而且效率要比标准操作方案约低一个数量级。
１）用适当的限制酶消化外源ＤＮＡ，其量应足以产生约0.2μg的靶片段。反应体积应为20μl或更小。在另一管中，用相应的限制酶消化约0.5μg载体ＤＮＡ，总反应体积为20μl或更小。如载体ＤＮＡ带相同的端，应用磷酸处理如下：用限制酶消化完全后，加2.5μl 100mmol/L Tris.Cl(pH8.3)、10mmol/L ZnCl2,加0.25单位牛小肠碱性磷酸酶，于37℃温育30分钟。
２）通过琼脂糖凝胶电泳分离目标片段。务必用低熔点琼脂糖灌制凝胶，务必用含溴化乙锭（0.5μg/ml）的１xTAE作为电泳缓冲液而不是常规的0.5xTBE来配制凝胶并进行电泳。
３）在长波长紫外照射下检查凝胶，根据目标条带的相对荧光强度估计所含ＤＮＡ的量（见附录Ｅ）。用刀片切出目标条带，尽可能少琼脂糖的体积（通常40-50μl)。将切下凝胶片分别放入作好标记的各个微量离心管中。
４）于70℃加热10-15分钏，使琼脂糖熔化。
５）合并熔化的小份凝胶并放到加温至37℃的中一管中，共终体积应不超过10μl,外源ＤＮＡ与质粒载体的摩尔比应接近２：１。
用另外两个管设立两个对照连反应，一个只含质粒载体，另一个只含外源ＤＮＡ片段。
６）将３个管于37℃温育5-10分钟，然后每管加10μl用冰预次的２xT４噬体ＤＮＡ连接酶混合物，在琼脂糖凝固前，充他混匀各管内容物，于16℃温育12-16小时。
２xT４噬菌体ＤＮＡ连接酶混合物可制备如下：
    1mol/L Tris.Cl(pH7.6) 1.0μl
    100mmol/L氯化镁 1.0μl
    200mmol/L三硫苏糖醇 1.0μl
    10mmol/L ATP 1.0μl
    水 5.5μl
Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶 １Ｗeiss单位
混匀后放置于冰浴上。
７）连接反应行将结束时，取出贮存于-70的３管各200μl的冻存大肠杆菌感受态细胞
８）于70℃中热10-15分钟重新溶化连接混合物中的琼脂糖。
９）立即从每管连接混全物中取出５μl加到200μl大肠杆菌感受态细胞中，小心摇晃，快速地混匀内容物。从剩下每管连接混合物中分别再取５μl重复以上步骤，将转化混合物在冰浴上放置30分钟。
10）完成转化方案的其余各步。