BONCAT

### 1. 定义与概念

BONCAT（Bioorthogonal Noncanonical Amino Acid Tagging）是一种用于研究蛋白质合成和动态变化的生物化学技术。该技术通过将非天然氨基酸掺入细胞的新合成蛋白质中，结合生物正交化学反应实现特异性标记和检测，广泛应用于蛋白质动态和代谢研究。

### 2. 工作原理

BONCAT的工作原理基于细胞内非天然氨基酸的掺入和特异性化学标记。主要步骤包括：

1. **非天然氨基酸掺入**：将含有生物正交功能团（如叠氮基团）的非天然氨基酸（如L-乙炔基酪氨酸，AHA或L-乙炔基赖氨酸，HPG）添加到细胞培养基中。细胞将这些非天然氨基酸掺入新合成的蛋白质中。

2. **生物正交化学反应**：利用特定的化学反应（如铜催化的叠氮-炔点击反应，CuAAC）将荧光基团或生物素标记物特异性地连接到含有非天然氨基酸的蛋白质上。

3. **检测与分析**：通过荧光显微镜或质谱等方法检测标记的蛋白质，分析其合成、定位和动态变化。

### 3. 技术步骤

BONCAT技术的实施包括以下几个步骤：

1. **细胞培养**：

   - 将细胞培养在含有非天然氨基酸的培养基中，通常是甲硫氨酸缺乏的培养基，以提高非天然氨基酸的掺入效率。

2. **非天然氨基酸掺入**：

   - 添加AHA或HPG等非天然氨基酸到培养基中，培养一段时间，使其掺入新合成的蛋白质中。

3. **化学标记**：

   - 利用CuAAC反应，将含有荧光基团（如Alexa Fluor）或生物素的探针与掺入非天然氨基酸的蛋白质进行点击化学反应，实现特异性标记。

4. **检测与分析**：

   - 通过荧光显微镜观察细胞中标记的蛋白质，或通过亲和纯化和质谱分析，鉴定新合成的蛋白质。

### 4. 应用

BONCAT技术在以下研究领域具有广泛应用：

1. **蛋白质合成动态研究**：

   - 监测细胞在不同条件下（如应激、药物处理）新合成蛋白质的动态变化。

2. **细胞分化和发育研究**：

   - 分析细胞在分化和发育过程中蛋白质表达的时空变化。

3. **疾病研究**：

   - 研究疾病状态下（如癌症、神经退行性疾病）新合成蛋白质的变化，寻找潜在的治疗靶点和生物标志物。

4. **药物筛选**：

   - 评估药物对蛋白质合成的影响，筛选和验证新药物的作用机制。

### 5. 优势与挑战

**优势**：

1. **高特异性**：利用生物正交化学反应，BONCAT技术具有高度特异性和灵敏度。

2. **实时动态监测**：能够实时监测细胞内新合成蛋白质的动态变化。

3. **广泛适用**：适用于多种细胞类型和实验条件，应用范围广泛。

**挑战**：

1. **非天然氨基酸的细胞毒性**：某些非天然氨基酸可能对细胞具有毒性，需要筛选和优化。

2. **标记效率和特异性**：点击化学反应的效率和特异性需要优化，以确保标记的准确性和灵敏度。

3. **技术复杂性**：BONCAT技术的实施需要多步骤操作和高精度实验技术，要求较高的实验技能和设备。

### 参考文献

1. Dieterich, D. C., Link, A. J., Graumann, J., Tirrell, D. A., & Schuman, E. M. (2006). Selective identification of newly synthesized proteins in mammalian cells using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging (BONCAT). *Proceedings of the National Academy of Sciences*, 103(25), 9482-9487.

2. Beatty, K. E., Liu, J. C., Xie, F., Dieterich, D. C., Schuman, E. M., & Wang, Q. (2006). Fluorescence visualization of newly synthesized proteins in mammalian cells. *Angewandte Chemie International Edition*, 45(44), 7364-7367.

3. Tom Dieck, S., Kochen, L., Hanus, C., Heumüller, M., Bartnik, I., Nassim-Assir, B., ... & Schuman, E. M. (2015). Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ. *Nature Methods*, 12(5), 411-414.

4. Hinz, F. I., Dieterich, D. C., Tirrell, D. A., & Schuman, E. M. (2012). Noncanonical amino acid labeling in vivo to visualize and affinity purify newly synthesized proteins in larval zebrafish. *ACS Chemical Neuroscience*, 3(1), 40-49.

5. Howarth, M., & Ting, A. Y. (2008). Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin. *Nature Protocols*, 3(3), 534-545.