全基因组甲基化测序

### 1. 定义与概念

全基因组甲基化测序（Whole-Genome Bisulfite Sequencing, WGBS）是一种高通量测序技术，用于分析基因组范围内的DNA甲基化状态。通过将基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理，测定DNA中每一个胞嘧啶（Cytosine）残基是否被甲基化，从而提供单碱基分辨率的甲基化图谱。

### 2. 工作原理

全基因组甲基化测序的核心是亚硫酸氢盐处理DNA，这一过程将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶（5mC）则不发生变化。随后通过高通量测序技术读取这些变化，并通过生物信息学分析确定每个碱基的甲基化状态。

### 3. 实验步骤

全基因组甲基化测序通常包括以下几个步骤：

1. **DNA提取**：

   - 从细胞或组织中提取高质量的基因组DNA。

2. **亚硫酸氢盐处理**：

   - 使用亚硫酸氢盐处理DNA，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。

3. **文库构建**：

   - 通过片段化、末端修复、加A尾和连接接头等步骤构建测序文库。

4. **高通量测序**：

   - 使用Illumina或其他高通量测序平台对文库进行测序，生成大量的短读序列（reads）。

5. **数据分析**：

   - 将测序数据比对到参考基因组，并通过特定的软件工具分析甲基化状态，生成基因组范围内的甲基化图谱。

### 4. 数据分析

全基因组甲基化测序的数据分析通常包括以下几个步骤：

1. **读序比对**：

   - 使用比对软件（如Bismark）将测序读序比对到参考基因组，识别亚硫酸氢盐处理后的C-to-T转换。

2. **甲基化调用**：

   - 根据比对结果，确定每个胞嘧啶残基的甲基化状态，生成甲基化调用文件（methylation call file）。

3. **甲基化图谱构建**：

   - 使用软件工具（如MethylKit、BSseq）分析甲基化数据，构建基因组范围内的甲基化图谱。

4. **差异甲基化分析**：

   - 比较不同样本或条件下的甲基化模式，识别差异甲基化区域（DMRs）。

### 5. 应用

全基因组甲基化测序在多个研究领域具有广泛应用：

1. **发育生物学**：

   - 研究不同发育阶段的基因组甲基化模式，揭示发育过程中甲基化的动态变化。

2. **癌症研究**：

   - 分析癌症中的甲基化异常，识别与肿瘤发生、发展相关的差异甲基化区域，寻找潜在的生物标志物和治疗靶点。

3. **表观遗传调控**：

   - 研究基因组甲基化在基因表达调控、染色质结构调控和细胞命运决定中的作用。

4. **环境与健康**：

   - 研究环境因素（如饮食、污染、压力）对基因组甲基化的影响，探索表观遗传在健康和疾病中的作用。

### 6. 优势与挑战

**优势**：

1. **高分辨率**：提供单碱基分辨率的甲基化信息，全面覆盖基因组。

2. **全面性**：能够分析基因组范围内的甲基化状态，识别全基因组范围内的差异甲基化区域。

**挑战**：

1. **高成本**：全基因组甲基化测序的成本较高，限制了大规模应用。

2. **数据处理复杂**：数据量大，分析过程复杂，需要强大的计算资源和专业的生物信息学分析能力。

### 参考文献

1. Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., ... & Ecker, J. R. (2009). Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. *Nature*, 462(7271), 315-322.

2. Harris, R. A., Wang, T., Coarfa, C., Nagarajan, R. P., Hong, C., Downey, S. L., ... & Milosavljevic, A. (2010). Comparison of sequencing-based methods to profile DNA methylation and identification of monoallelic epigenetic modifications. *Nature Biotechnology*, 28(10), 1097-1105.

3. Ziller, M. J., Müller, F., Liao, J., Zhang, Y., Gu, H., Bock, C., ... & Meissner, A. (2011). Genomic distribution and inter-sample variation of non-CpG methylation across human cell types. *PLoS Genetics*, 7(12), e1002389.

4. Bock, C. (2012). Analysing and interpreting DNA methylation data. *Nature Reviews Genetics*, 13(10), 705-719.

5. Smallwood, S. A., & Kelsey, G. (2012). De novo DNA methylation: a germ cell perspective. *Trends in Genetics*, 28(1), 33-42.