光漂白

光漂白（Photobleaching）是指荧光染料或荧光蛋白在持续光照下，荧光强度逐渐减弱甚至消失的现象。光漂白是荧光显微镜技术中的一个常见问题，影响了长时间成像实验的稳定性和准确性。

1. **机制**

   光漂白的发生是由于荧光分子在激发光照射下发生不可逆的化学反应，导致其荧光性质的改变或完全失去荧光能力。具体机制包括：

   - **单重态和三重态转化**：荧光分子在吸收光子后，从基态跃迁到激发态，并通过发射荧光返回基态。在这一过程中，部分荧光分子会通过系统间交叉（Intersystem Crossing）进入三重态。这一状态较长寿命，容易发生与周围分子（如氧分子）的反应，导致荧光分子结构的永久性破坏。

   - **氧化反应**：在三重态下，荧光分子更容易与氧气发生反应，生成自由基或其他氧化产物，这些产物会进一步破坏荧光分子。

   - **光敏剂作用**：荧光分子自身或周围环境中的光敏剂在光照下生成活性氧物质，这些活性氧进一步加剧荧光分子的降解。

2. **影响因素**

   光漂白的程度受多种因素影响，包括：

   - **光强度和光源类型**：高强度的激发光会加速光漂白的发生，不同波长的光源对荧光分子的影响也不同。

   - **荧光分子的结构**：不同的荧光染料或荧光蛋白对光漂白的敏感度不同，化学结构决定了其抗光漂白的能力。

   - **环境条件**：氧气浓度、pH值、温度等环境因素也会影响光漂白的速度和程度。

3. **减缓光漂白的方法**

   为了减缓光漂白，提高长时间成像实验的稳定性，可以采取以下措施：

   - **降低光强度**：适当降低激发光的强度，减少光漂白的发生。

   - **使用抗光漂白剂**：在样品中添加抗光漂白剂，如抗坏血酸、Trolox等，可以有效减少光漂白。

   - **优化荧光分子选择**：选择抗光漂白性能较好的荧光染料或荧光蛋白，如某些新型的荧光蛋白变体或有机染料。

   - **改进成像技术**：采用共焦显微镜、多光子显微镜等技术，减少样品的整体光照暴露，集中在观测区域进行成像。

4. **应用与挑战**

   虽然采取了多种措施减缓光漂白，但在某些高分辨率和长时间成像实验中，光漂白仍然是一个挑战。特别是在单分子成像和活细胞成像中，光漂白会影响数据的准确性和再现性。因此，光漂白的研究和控制仍是显微镜技术发展的重要方向。

参考文献：

1. Patterson, G., Davidson, M., Manley, S., & Lippincott-Schwartz, J. (2010). Superresolution imaging using single-molecule localization. **Annual Review of Physical Chemistry**, 61, 345-367.

2. Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., & Hell, S. W. (2007). 2,6-Diaminopurine minimizes photobleaching and phototoxicity in super-resolution fluorescence microscopy. **Nano Letters**, 7(11), 3145-3150.

3. Axelrod, D. (1989). Fluorescence photobleaching recovery and imaging techniques. **Methods in Cell Biology**, 30, 245-270.

4. Liu, Z., Lavis, L. D., & Betzig, E. (2015). Imaging live-cell dynamics and structure at the single-molecule level. **Molecular Cell**, 58(4), 644-659.

5. Song, L., Varma, C. A., Verhoeven, J. W., & Tanke, H. J. (1995). Influence of the triplet excited state on the photobleaching kinetics of fluorescein in microscopy. **Biophysical Journal**, 68(6), 2588-2600.