凝集素
1.作为细胞分化和成熟的标记 应用凝集素作为细胞分化的标志,在这方面的应用报告最多,而且研究比较集中于血细胞,特别是淋巴细胞的分群。如Rose(1980)等发现在小鼠胸腺皮质内不成熟的T淋巴细胞呈PNA阳性反应,在小鼠小肠集合淋巴小结的生发中心也发现有20%左右的PNA阳性反应细胞,后者是否属于不成熟的T淋巴细胞,是值得进一步研究的问题。Newman等(1979)以荧光素标记凝集素PNA,发现在大鼠乳腺上皮的不同分化时期显示不同的荧光强度。在不成熟的大鼠乳腺上皮细胞,荧光弱或无,随着性成熟期到妊娠期乳腺上皮荧光程度逐渐加强,而泌乳期荧光强度达最高峰。在皮肤角质细胞自基底向表层分化、成熟的过程中,细胞表面的碳水化合物的分布和性质都在改变。Brabed等(1981)应用新生大鼠皮肤的实验表明,皮肤各层细胞分别与不同的凝集素相结合。麦芽素与角质化细胞相结合,蓖麻素与棘细胞和基底细胞相结合,而荆豆凝集素标记在棘细胞的表面。在成肌细胞(myeoblast)的分化与成熟过程中,Winaod 和Luzzati(1975)注意到类似的皮肤的改变。
2.作为细胞特殊类型的标记 Kivela和Farkkanen(1987)发现在人视网膜,PNA标记视锥细胞而不标记视杆细胞。在乳腺、乳腺上皮细胞呈PNA阳性反应而肌上皮细胞和间质细胞呈PNA阴性反应。以多种凝集素对小鼠、大鼠和兔的肾组织切片进行染色结果表明,刀豆素A和蓖麻素存在于肾脏的各部,PNA和双花扁豆凝集素(DBA)主要分布于远曲小管和集合小管上皮细胞,荆豆凝集素(UEA)主要分布在血管内皮细胞,而麦芽素分布在肾小球。应用DBA对RIII和DDK品种的小鼠研究表明,DBA主要结合在各种组织内毛细血管内皮细胞上,电镜观察显示DBA结合在内皮细胞的表面,在趣的是在RIII品系小鼠某些组织的内皮细胞显示肯定的DBA阴性反应,说明同一种属动物的血管内皮细胞也存在有组织特异性的差别。Streit和Kreutzberg(1987)发现GriffoniaSimplicifolia凝集素特异性标记面神经节 内的小胶质细胞,其它类型的胶质细胞如星状胶质细胞(astrocyte)等都显示阴性反应。在切断面神经后,增殖的小胶质细胞对Griffonia Simplicifolia凝集素的反应加强,免疫电镜观察表明,凝集素主要沉积在细胞膜或小胶质细胞突起的轴膜表面,特异性结合糖基是α—D—半乳糖。上海医科大学附属肿瘤医院免疫病理室应用12种凝集素(表6-1)对人胚胎及各种正常组织进行了系统的凝集素受体的定位研究,结果表明,凝集素受体的分布并无即定规律可寻。如胃粘膜主细胞为PNA受体,而壁细胞为BSL受体,双花扁豆受体(DBA)主要出现在大肠部份。
3.在肿瘤中凝集素结合的改变 肿瘤细胞伴有细胞膜的改变,细胞膜上的糖基也会产生相应的变化,可用凝集素检测出来。大量研究发现,凝集素可作为肿瘤组织源性的标记、肿瘤特异性诊断的标志、肿瘤恶性的标记和不同肿瘤的分化标记。如张华忠等(1987)报道115例胃癌标记PHA阳性率高达90.43%,而正常胃粘膜基本是阴性,故认为PHA是胃癌的诊断性标志。BSA对乳腺恶性肿瘤阳性率达79%,而对良性病变均呈阴性反应,提示BSA可能为乳腺恶性肿瘤的相关标志。凝集素还有助于判别肿瘤的组织类型,如神经系统星形细胞瘤ConA阳性,小胶质细胞瘤阴性,肾腺癌UEA1阴性,透明细胞癌阳性。
1.直接法 标记物直接标记在凝集素上,使之直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合。
(1)切片脱蜡至水。
(2)凝集素标记物(100μg/ml),室温,30min。
(3)TBS洗3次,每次2min。
(4)如为荧光素标记物,封片用荧光显微镜观察。如为酶标记物,则应依次进行呈色、脱水、透明和封固后在光学显微下观察。
直接法的优点是简便,目前商品用的凝集素药盒已能购得。但灵敏性不够高。
2.间接法 将凝集素直接与切片中的相应糖基结合,而将标记物结合在抗凝集素抗体上。
(1)脱蜡至水。
(2)用含3%的H2O2的甲醇阻断内源性过氧化物酶10min。
(3)凝集素稀释液(100μg/ml)孵育30min。
(4)TBS洗3次,每次2min。
(5)用标记了的抗凝集素抗体(1:100)孵育30min。
(6)TBS洗3次,每次2min。
(7)呈色、脱水、透明、封片。
(8)观察。
间接法染色还可进一步改良为:①三步法:即在凝集素孵育后,接着用抗凝集素抗体孵育,再用标记了的抗-抗凝集素抗体孵育,层层放大,进一步提高其敏感性,PAP复合物也可作为标记物标记在抗-抗凝集素抗体上。②抗生物素—生物素凝集素法:用结合了生物素的凝集素孵育切片后,TBS洗后再以抗生物素—标记物与之结合。间接法较直接法和直接法敏感性高5~10倍或更多一些,但必须购买或自制抗凝集素抗体。
3.糖—凝集素—糖法 本法是利用过量的凝集素与组织切片中特定的糖基相结合。经冲洗后,凝集素上还存在未被占用的结合部位,将这些部位与有过氧化物酶标记的特异性糖基相结合,形成一个三明治样的糖—凝集素—糖的结合物。
(1)脱蜡至水。
(2)用含3%的H2O2的甲醇阻断内源性过氧化物酶10min。
(3)用100μg/ml的凝集素孵育30min。
(4)TBS洗3次,每次3min。
(5)用100μg/mlHRP标记的糖液孵育30min。
(6)TBS洗3次,每次3min。
(7)DAB呈色、脱水、透明、封固。
本法特异性强,灵敏度高,因为这不象生物素—抗生物素法那样要改变凝集素,又不需要像抗体那样要制备抗体。HRP本身含有甘露糖,能与刀豆凝集素A、扁豆凝集素和豌豆凝集素结合。但对其它的凝集素,本法目前普及还有一定困难,因为要将过氧化物酶结合到其它凝集素上,就需要将一个适当的碳水化合物基团嵌入过氧化物酶,称为糖基化(glycosylation),方法虽不复杂(Lee 等1976),但需一定的试剂和设备。商品化能提供的糖基化过氧化物酶品种尚有限。
②和其它抗体血清应用一样, 应用每批新的凝集素实验时,都先要用缓冲液稀释成不同等级;如8,16,32,64,125,250,500,1000μg/ml,经染色选择最佳稀释度。
③有作者认为阻断组织内源性过氧化物酶所用的H2O2对碳水化合物有影响,可能改变凝集素的结合形式,因此,应尽量少用或不用,我们及一些作者在实验过程中发现影响不明显。
④有作者认为凡经固定的组织切片,不论是石蜡包埋切片或冰冻切片,都有可能使组织中抗原隐蔽,为了暴露隐蔽了的碳水化合物基团,主张在凝集素孵育前用酶处理切片,常用胰蛋白酶液(配制见附表)进行适当的孵育。
⑤已知哺乳动物的质膜含有占蛋白总量的1%~10%的碳水化合物,它们以低聚糖(oligosacchride)糖脂,并主要以糖蛋白的形式存在,糖蛋白线性的或分支的旁链可能含有两个到多个单糖残基,通常有两种或更多的单糖,在单糖单位末端常常是一个带负电荷的N-乙酰神经氨酸的残基,一个唾液酸(siallic acid)。有作者在凝集素实验中常用神经氨酸酶(neuramidinase)分解细胞表面的唾液酸或神经氨酸,以暴露出隐蔽的能与聚集素结合的次终末的碳水化合物。配制方法是将神经氨酸酶(Type V,Sigma Lot 63F-8172 63F-8172)用醋酸缓冲液(含2%牛血清白蛋白)BSA配成0.5μg/ml。
切片脱蜡后进行酶消化的过程中,将该组织切片置于上述配制液中,在湿盒内,37℃孵育30min。用缓冲液洗后,进行凝集素染色。
⑥对照试验,和其它组化染色一样,凝集素染色也需要设对照试验(最好在相邻切片进行)。由于凝集素具有单糖特异性,如果外加相应的糖,把凝集素的结合部位占有了,凝集素就不能再与组织中的糖基相结合了。一般采用的方法是将凝集素预先与相应的糖(0.2mol/L)在室温孵育30min,使之占有凝集素结合部位,再将此液代替凝集素进行孵育,结果应为阴性。在某些情况下即使提高糖液的浓度也不能达到完全的抑制。这时,只有用与凝集素有高亲合力的低聚糖(oligosachrides)代替或将切片预先用相应的糖苷酶孵育去除特异性糖基(Watanalte等,1981)。
(1)HRP的活化
①将10mg HRP(SigmaType VI)溶解在1ml 0.3mol/L 的重碳酸钠溶液中(1.25g/50ml)。
②加50μl含1%氟二硝基苯的无水乙醇溶液,室温轻度搅拌1h。
③加1ml含0.06mol/L的过碘酸钠的蒸馏水(0.62g/50ml),室温下轻度搅拌30min。
④在室温下加两滴0.16mol/L乙二醇,轻搅1h。
⑤用Sephadex G-25装成小柱,用0.3mol/L的重碳酸钠溶液,使含HRP的混合液过柱。
(2)结合
①正常条件下,可用凝集素及过氧化物酶各半量,但其比例可根据需要调整,以10mg凝集素溶解在25ml的重碳酸盐缓冲液里,加到“活化”的HRP中去 ,这样得出的凝集素浓度大约是0.3mg/ml,可加进0.1mol/L相应的特异的糖,以保护凝集素结合时的结合部位。糖在下步透析或层析时去掉。
②在室温下轻搅拌,结合3h。
③加入1mg硼氢化钠,室温下作用1h以稳定结合物活性。
④用1N HCl调整pH至6.4,留置室温下过夜。
(3)纯化
①用适当的凝胶层析柱如SephadexG—200、Saphacryl—300层析法将游离的凝集素、游离的过氧化物酶和高分子量的成分从结合物分离出去,包括抑制性的糖也在此时分离出去。
②提纯后的结合物在280nm和403nm波长处测量其吸光率。用1%BSA先通过0.22μm的微孔过滤器,以确定被结合的凝集素是否被吸附在滤器中,然后上述结合物经过该微孔滤过器过滤到一个无菌瓶中。
③加入叠氮钠,浓度1:1000,保存于4℃C备用。
2.抗凝集素抗体的制备 抗凝集素抗体的制备法与一般免疫血清制备大致相同。所不同的是:①凝集素具有较强的毒性,易使被免疫动物发病或甚至死亡。解决的方法是经处理使凝集素变性,从而减低其毒性,但同时要保证其抗原性不受或少受破坏。②要设法阻断凝集素的糖结合部位,以减少对这些部位的抗体的产生,解决的办法是预先以相应的糖阻断这些结合部位。Leathem 和Atkin(1982)设计了一个办法,他们首先应用琼脂糖(Sepharose)珠,珠上有一系列共价糖的附着,这些糖可阻断凝集素结合部位,这种糖珠有商品供应(Sigma LtD),每1ml糖珠能结合大约12mg凝集素。其次用加入福尔马林和加热的方法使凝集素变性,毒性减低而不影响抗原性。具体操作如下:
①1ml琼脂糖—半乳糖珠与1mg花生凝集素相结合,室温1h。
②加入10ml 10%福尔马林,在水浴中加热到60℃,1h。
③用盐水离心洗珠,将珠分成以10μl为单位的若干小份,保存在-20℃。
④皮下多处注射两只家兔背部,每次注射100μl,每隔三周注射一次。取血40~50ml,保存在-20℃备用。
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