WESTERN印迹法
Western Blot（蛋白质印迹法）技术详解
一、基本原理
Western Blot是一种用于检测特定蛋白质在复杂混合物中表达水平的技术，结合电泳分离与抗体特异性识别，通过以下步骤实现：
SDS-PAGE电泳：根据分子量分离蛋白质。
转膜：将分离的蛋白转移到固相膜（如PVDF或硝酸纤维素膜）。
抗体检测：利用一抗结合目标蛋白，二抗（标记酶或荧光基团）放大信号。
显色/成像：化学发光、荧光或显色底物检测目标蛋白。
二、实验步骤与关键细节
| 步骤 | 操作要点 | 常见问题与优化 |
|---|---|---|
| 1. 样品制备 | - 使用RIPA裂解液提取总蛋白，添加蛋白酶抑制剂。 - 沸水浴变性（5-10分钟，含SDS和DTT）。 | 问题：蛋白降解。 优化：冰上操作，分装保存。 |
| 2. SDS-PAGE电泳 | - 根据目标蛋白分子量选择凝胶浓度（如10%-12%）。 - 预染Marker指示迁移位置。 | 问题：条带弥散。 优化：确保新鲜配胶，避免气泡。 |
| 3. 转膜 | - 湿转（100V，1-2h）或半干转（25V，30min）。 - 甲醇激活PVDF膜，增强蛋白结合。 | 问题：转膜不均。 优化：用丽春红染色验证转膜效率。 |
| 4. 封闭 | - 5%脱脂奶粉或BSA（磷酸化蛋白用BSA）封闭1小时，减少非特异性结合。 | 问题：背景高。 优化：延长封闭时间或更换封闭剂。 |
| 5. 一抗孵育 | - 4℃过夜或室温2小时，稀释比例（通常1:1000，参考抗体说明书）。 | 问题：信号弱。 优化：提高一抗浓度或延长孵育时间。 |
| 6. 二抗孵育 | - HRP或荧光标记二抗，室温1小时，避光操作（荧光二抗）。 | 问题：交叉反应。 优化：使用种属特异性二抗。 |
| 7. 检测 | - 化学发光：ECL底物曝光，调整曝光时间。 - 荧光：直接扫描，避免膜干燥。 | 问题：信号过曝。 优化：稀释底物或缩短曝光时间。 |
三、关键试剂与选择建议
| 试剂 | 作用 | 推荐品牌/类型 | 注意事项 |
|---|---|---|---|
| 裂解液 | 破碎细胞，释放蛋白 | RIPA（含蛋白酶/磷酸酶抑制剂） | 磷酸化蛋白需添加磷酸酶抑制剂。 |
| 一抗 | 特异性识别目标蛋白 | CST（Cell Signaling）、Abcam、Santa Cruz | 验证抗体种属反应性（人、小鼠、大鼠）。 |
| 二抗 | 结合一抗并携带检测标记 | HRP标记（抗兔/抗小鼠） | 避免反复冻融，分装保存。 |
| 封闭剂 | 减少非特异性结合 | 5%脱脂奶粉（常规）或BSA（磷酸化蛋白） | 磷酸化检测避免使用含酪蛋白的奶粉。 |
| 显影底物 | 产生化学或荧光信号 | ECL超敏底液（Thermo） | 避光保存，现用现配。 |
四、常见问题与解决方案
| 问题现象 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 无信号 | - 一抗/二抗失效 - 转膜失败 | 验证抗体活性（阳性对照），丽春红检测转膜。 |
| 非特异性条带 | - 抗体交叉反应 - 封闭不充分 | 更换高特异性抗体，延长封闭时间。 |
| 背景高 | - 二抗浓度过高 - 洗涤不充分 | 降低二抗浓度，增加TBST洗涤次数（3×10分钟）。 |
| 条带拖尾 | - 蛋白过载 - 电泳电压过高 | 减少上样量，降低电泳电压。 |
五、数据分析与标准化
内参蛋白：
常用β-actin、GAPDH、Tubulin，确保上样量一致。
磷酸化蛋白需同时检测总蛋白及磷酸化形式（如p-ERK vs. ERK）。
软件分析：
ImageJ、Image Lab（Bio-Rad）定量条带灰度值。
结果展示：
目标蛋白与内参比值表示相对表达量，统计差异（t-test/ANOVA）。
六、替代技术与前沿进展
快速Western：
Wes（ProteinSimple）：自动化毛细管电泳，1天完成检测，节省时间。
多重荧光检测：
不同荧光标记二抗同时检测多个蛋白（需激光扫描仪）。
无抗体检测：
质谱技术（如靶向PRM）直接定量，但成本高、通量低。
总结
Western Blot是蛋白质研究的基石技术，成功的关键在于：
严格对照（阳性/阴性对照、内参）。
抗体优化（验证特异性、最佳稀释比）。
细节把控（转膜效率、封闭充分性）。
对于新手，建议从成熟抗体和高表达样本（如β-actin）入手，逐步掌握条件优化技巧。遇到问题时，系统排查各步骤（如转膜验证、抗体交叉反应），结合文献方案调整策略。随着技术发展，自动化平台（如Wes）正逐步简化流程，但传统Western仍是实验室必备技能。
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