mRNA

信使RNA（mRNA）是分子生物学中心法则中的关键分子，负责将DNA中存储的遗传信息传递至核糖体，指导蛋白质合成。mRNA的功能、结构和调控机制在原核生物与真核生物中展现出显著差异，其多顺反子特性在基因表达和生物技术应用中被广泛研究。本文全面梳理mRNA的基本特征、结构与功能关系、表达系统及应用前景。

mRNA存在于原核和真核生物的细胞质及真核细胞的某些细胞器（如线粒体、叶绿体）中。RNA病毒和RNA噬菌体中的RNA既是遗传信息的载体又具有mRNA的功能。生物体mRNA种类的多少与生物进化水平有关：高等生物所含的遗传信息多，mRNA的种类也多。生物体内某种mRNA的含量根据需要而有不同，如5龄蚕后部丝腺体的主要任务是快速合成大量丝心蛋白，因而编码丝心蛋白的mRNA含量特别多。有些细菌需要不断适应外部环境，其体内编码某些诱导酶的mRNA的含量也较多。

原核生物mRNA

原核生物mRNA一般5'端有一段不翻译区（前导顺序），3'端有一段不翻译区，中间是蛋白质的编码区，一般编码几种蛋白质。例如，大肠杆菌乳糖操纵子mRNA编码3条多肽链；色氨酸操纵子mRNA编码5条肽链。也有单顺反子形式的细菌mRNA，如大肠杆菌脂蛋白mRNA。原核生物mRNA分子中一般没有修饰核苷酸，也没有5'端帽子结构和3'端聚腺苷酸尾巴。在原核生物mRNA的起始密码子（AUG）附近（5'方向上溯）有一小段长短不等的顺序，含有较多的嘌呤核苷酸，被称为SD顺序，它能和核糖体小亚基上的16S rRNA的3'端富含嘧啶核苷酸的区域配对结合，有助于带有甲酰甲硫氨酸的起始tRNA识别mRNA上的起始密码子（AUG），使肽链合成从此开始。SD顺序由J.夏因和L.达尔加诺于1974年发现，也称核糖体结合部位。原核生物mRNA的编码区一般编码几种功能上相关联的蛋白质，两种蛋白质的编码区之间常有一小段不翻译的顺序，叫做间隔区。有的噬菌体RNA中2个相邻的顺反子共用一段相同的编码顺序，例如，M噬菌体RNA中的溶菌蛋白编码区共225个核苷酸中有189个核苷酸是由相邻两个蛋白质共用的。原核mRNA与真核mRNA一样使用同一套三联体密码子（真核生物线粒体mRNA有例外）。原核生物合成氨基酸的操纵子mRNA的5'端前导顺序上有一段顺序称作弱化子，具有两种可以互变的构象，其中一种构象是转录终止的信号，能使转录中止（或衰减），衰减调节是原核生物合成氨基酸的调控方式之一。

真核生物mRNA

真核生物mRNA（细胞质中的）一般由5'端帽子结构、5'端不翻译区、翻译区（编码区）、3'端不翻译区和3'端聚腺苷酸尾巴构成。分子中除G构成帽子外，常含有其他修饰核苷酸，如A等。5'端帽子结构通常有3种类型，即：G(5')ppp(5')N；G(5')ppp(5')N和G(5')ppp(5')N。帽子结构中的m代表核糖2'位羟基的甲基化。真核细胞线粒体中的mRNA无帽子结构，一般认为帽子的功能与翻译的启动有关，如珠蛋白mRNA除去帽子后翻译效率大大降低。5'端不翻译区（前导顺序）长度不同，有的只有10个核苷酸，有的则有200个核苷酸。与原核mRNA相似，真核mRNA5'端不翻译区常有一段顺序与核糖体小亚基上的18S rRNA的3'端的一段顺序互补结合，这种结合与真核mRNA的翻译启动有关。翻译区使用的密码子除线粒体（如人、牛和酵母线粒体）外与原核生物mRNA一样，起始密码子都是AUG，也都有“简并现象”，但不同mRNA中简并密码子的利用率不同，真核与原核生物之间差别更大。终止密码子有3个（UAG、UGA和UAA），一般只用一个终止密码子就能使翻译停止，有的mRNA有2个连续的终止密码子。3'端不翻译区的长短在不同的mRNA上有所不同，β珠蛋白mRNA只有39个核苷酸，而卵白蛋白mRNA则有637个核苷酸。真核生物mRNA 3'端不翻译区常有AAUAA(A)或AUUUA(A)等顺序，它们与识别多聚A聚合酶及装配多聚A尾巴有关。除个别组蛋白mRNA外，真核生物mRNA 3'端均有多聚A尾巴，长度随来源不同而不同，且随mRNA的老化而变短，通常有20～200个A，多聚A与mRNA稳定性及mRNA从细胞核转到细胞浆中有关。

多顺反子mRNA在原核生物中常见，通常是几种不同的mRNA连在一起，相互之间由一段短的不编码蛋白质的间隔序列所隔开。顺反子的概念来自遗传学中的顺反重组试验，是确定交换片段究竟在一个基因内还是属于两个基因的试验，简言之，一个顺反子就是一个基因，多顺反子就是多个基因。真核生物中也有多顺反子，比如C. elegans共有13500个基因，约25%的是多顺反子（polycistronic mRNA）。

此处描述的是一个新型的表达系统，用以从一个单一多顺反子构建体中产生目的多基因产物。尤其是，该表达系统包含一个多顺反子载体，能够在真核宿主细胞中表达功能抗体，其中载体在5'-3'方向上至少包含下面的可操作连接的元件：在真核细胞可操作的启动子；编码至少抗体轻链可变区的DNA序列；内部核糖体进入位点（IRES）；以及至少一个编码抗体重链的DNA序列。也公开了包含多顺反子表达载体的哺乳动物细胞，和一种在用多顺反子表达载体转染的哺乳动物细胞中产生功能抗体的方法。

来自德国科隆大学遗传学系的Joël Savard、Diethard Tautz等人发现拟谷盗（Tribolium，一种昆虫）中的一个分节基因（Segmentation gene）能够产生一种编码多种保守肽的多顺反子mRNA。昆虫的分节基因是早期胚胎产生体节必需的。在这篇论文中，德国的研究人员描述了拟谷盗的分节基因的gap家族的一个新成员mlpt。Mlpt基因的敲除会导致昆虫腹节变成胸节，从而使胚胎产生多达10对足。研究人员证实在mlpt和已知的拟谷盗gap基因之间发生着交互调节反应，表明mlpt本身就是一个gap基因（裂缺基因）。Mlpt基因能反映出一种不同寻常的结构，因为它编码一种多顺反子mRNA，而这种mRNA又编码四种肽。由于在其他昆虫基因组中也发现了具有多顺反子排列的同源基因，因此研究人员推测Mlpt似乎是真核细胞中这种先前未知的基因结构的原型。

核仁小分子RNA（snoRNA）是一类在真核生物核糖体生物合成过程中起重要作用的小分子RNA。通过计算机分析国际分子生物学数据库及实验的方法，在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中发现和鉴定了一个新的snoRNA（Z8）及其特殊的基因组织。Z8 snoRNA基因位于酿酒酵母第13号染色体上，是酵母snoRNA基因簇的第1个基因，编码box C/D类反义snoRNA。结构分析指出该snoRNA指导25S rRNA中第2421位尿苷酸的核糖的甲基化。用遗传学方法将该基因缺失后，其对应位点的甲基化被取消，但细胞的生长并未受到影响。Z8 snoRNA基因的上游247位，有一UsnoRNA启动子保守元素。RT PCR的结果证明，Z8与该基因簇中其他snoRNA（Z7和Z6）基因共同转录成一个多顺反子的snoRNA前体，然后再被加工成熟，这是一种新的snoRNA基因表达方式。

• 水稻质体多顺反子表达载体：根据已发表的相关序列，分别设计引物，通过PCR技术克隆了一系列构建水稻质体多顺反子定点整合表达载体所需的元件：质体核糖体(16S)RNA操纵元启动子（Prrn）、质体psbA基因3′端终止子（psbA3′）、氨基糖苷3′-腺苷酰基转移酶基因（aadA）、水稻质体基因组高频同源重组片段(psbC/trnG，大小3362bp)，命名为crDNA、甘露聚糖酶基因（man）、绿色荧光蛋白基因（gfp）。构建了水稻质体多顺反子定点整合表达载体pLM21(-psbC-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3′-trnG-)。将该载体用基因枪轰击烟草叶片5枪，用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选。结果获得质体转基因烟草4株。用PCR、激光扫描和Western blot等方法检测都证实man、gfp、aadA三个基因且均得到表达，用RFLP证实表达盒整合到烟草质体基因组中。
• 多顺反子逆转录病毒载体构建：利用脑心肌炎病毒(EMCV)及脊髓灰质炎(Polio)病毒内核糖体进入位点(IRES)，连接mIL-12p40及p35 cDNAs和筛选基因新霉素磷酸转移酶(NeoR)，克隆至逆转录病毒载体pGCEN中，使三个基因同时受逆转录病毒载体5′端LTR启动子控制，转录至同一mRNA转录本上，通过不同机制翻译成蛋白质，从而构建成多顺反子逆转录病毒载体，即pGCEN/mIL-12。在LipofectAMINE介导下将pGCEN/mIL-12转染包装细胞PA317，G418筛选，直至出现阳性克隆，挑取抗性克隆，扩大培养，收集上清，用小鼠成纤维细胞NIH3T3测定病毒滴度。然后用重组转录病毒感染小鼠肝癌细胞MM45T.Li，G418筛选，直至出现抗性克隆，扩大培养，对阳性克隆进行鉴定。结果是由PA317包装细胞产生的重组逆转录病毒的滴度为5×10^5 CFU/ml，将其感染小鼠肝癌细胞MM45T.Li后，经PCR及Southern blot证明，外源基因已整合至小鼠肝癌细胞基因组中，RT-PCR及Northern blot分析外源基因在mRNA水平上的表达，并证实mIL-12p40及p35 cDNA和NeoR基因转录在同一mRNA上。ELISA显示mIL-12的表达量48 h为10 ng/10^6细胞。并且M45/mIL-12培养上清能刺激人外周血单个核细胞增殖及诱导小鼠脾细胞IFN-γ的产生(160 U/ml)。
• 基因治疗策略：目前一种新的基因治疗策略，即将不同耐药谱基因导入正常骨髓造血干细胞获得耐药表型，加大造血细胞与肿瘤细胞克隆之间对化疗耐受性的差别，增加骨髓对化疗的耐受性，以便能施行大剂量化疗、多次重复给药使之最大限度清除肿瘤细胞，发挥化疗效果，为保护和及时恢复造血功能提供了可行性。本研究中造血干细胞采用的是脐血干细胞、外周血CD34+细胞和小鼠骨髓细胞，转染靶细胞显示对化疗药物的抗性增加。有效表达增加了细胞对亚硝基类药物（如BCNU）的耐受性，证实该基因具有明显的细胞生物学效应。同时通过体外诱导突变技术获得了突变型MGMT，并成功构建到逆转录病毒载体上。本研究为国内首次以RT-PCR方法从人肝组织克隆了O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）基因，与人类基因文库MGMT基因同源性比为100%，将该基因导入靶细胞后显示有效表达，增加了细胞对亚硝基类药物（如BCNU）的耐受性。同时通过体外诱导突变技术获得了突变型MGMT，并成功构建到逆转录病毒载体上。本研究课题还构建了国内外尚未报道的含ALDH1、ALDH3基因与IRES-MDR1基因的双顺反子逆病毒表达载体，证实了ALDH1、ALDH3均有抗活性环磷酰胺作用。在多顺反子逆病毒表达载体GLNA-MGMT-NEOR-IRES-MDR1中，利用NEOR基因和MDR1的双重作用建立了双标记系统。研究中涉及到了DNA序列分析、乒乓效应、RT-PCR、PCR、Northern blot、Western blot、FACS、MTT、建立高滴度产病毒细胞体系和安全高效的基因转移系统。

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