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革兰氏染色

革兰氏染色是一种经验性的细菌鉴别染色法，由丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰于1884年创立。它的核心价值在于能够根据细菌细胞壁化学成分和结构的根本差异，将绝大多数细菌快速分为两大类：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。这一分类至今仍是细菌鉴定、感染诊断和抗生素初步选择的基础。

核心原理：为什么细菌会染成不同颜色？

关键在于细胞壁的结构差异以及由此导致的结晶紫-碘复合物滞留能力不同。

细胞壁特征	革兰氏阳性菌	革兰氏阴性菌
结构	厚而致密的肽聚糖层（20-80 nm），形成多层网状结构。	薄肽聚糖层（2-7 nm），外侧有复杂的外膜。
主要成分	肽聚糖、磷壁酸。	肽聚糖、外膜（含脂多糖LPS、脂蛋白、磷脂）。
脱色关键	厚的肽聚糖层在脱水（酒精/丙酮）后收缩，孔隙变小，能将结晶紫-碘复合物牢牢“锁”在细胞内。	薄肽聚糖层无法有效阻挡脱色剂，且外膜被酒精溶解，结晶紫-碘复合物极易被洗脱。
复染结果	保持初染的紫色，不被复染剂影响。	初染紫色被脱去后，被红色的复染剂（番红/沙黄）着色。

简单比喻：

革兰氏阳性菌像穿着一件厚实的羊毛衫（肽聚糖），酒精会使羊毛缩水，把染料紧紧裹在里面。
革兰氏阴性菌像穿了一件薄T恤（肽聚糖）外面套了件防水外套（外膜）。酒精会把外套溶解，T恤挡不住染料流失，最后被换上了红衣服。

标准染色步骤（四步法）

涂片固定：制作细菌涂片，加热或甲醇固定。
初染（结晶紫）：滴加结晶紫染液，染色60秒，水洗。所有细菌都被染成紫色。
媒染（碘液）：滴加卢戈氏碘液，染色60秒，水洗。碘与结晶紫形成分子量更大、溶解度更低的结晶紫-碘复合物，增强染色强度。
脱色（酒精/丙酮）：这是最关键、最需要经验的一步。滴加95%酒精或丙酮-酒精混合液，轻轻冲洗约10-30秒，至流下的液体基本无色，立即水洗。革兰氏阳性菌保留紫色，革兰氏阴性菌紫色被脱去。
复染（番红/沙黄）：滴加番红或沙黄染液，染色60秒，水洗，吸水纸吸干。
镜检：油镜下观察。

染色结果与判读

观察特征	革兰氏阳性菌	革兰氏阴性菌
最终颜色	紫色/蓝紫色	红色/粉红色
代表菌属	葡萄球菌、链球菌、肠球菌、李斯特菌、芽孢杆菌、梭菌	大肠杆菌、克雷伯菌、沙门氏菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌、奈瑟菌、嗜血杆菌
细胞形态	可进一步观察是球菌（如葡萄状、链状）还是杆菌。	可进一步观察是球菌（如双球菌）、杆菌还是弧菌。

镜下示例：

金黄色葡萄球菌：革兰氏阳性，紫色，葡萄串状排列的球菌。
大肠杆菌：革兰氏阴性，红色，散在的短杆菌。

应用价值

临床感染诊断的“第一步”：
- 快速（15分钟内）为医生提供关键信息，指导经验性抗生素治疗（如青霉素类对多数G⁺菌有效，而对G⁻菌需考虑不同药物）。
- 对脑膜炎、菌血症、肺炎、尿路感染等的体液（脑脊液、血、痰、尿）标本进行直接涂片染色，有时甚至在培养结果出来前就能给出关键诊断。
微生物学鉴定基础：是任何细菌分离鉴定流程的起始步骤。
标本质量评估：如痰涂片检查白细胞和上皮细胞数量，评估痰标本是否合格。
质量控制：实验室常用已知的金黄色葡萄球菌（G⁺）和大肠杆菌（G⁻）作为对照，确保染色试剂和操作准确。

关键注意事项与常见误差

革兰氏染色看似简单，但极易出现误差，需要严格操作。

常见问题	原因与后果
假阳性（应是G⁻却呈G⁺）	脱色不充分：脱色时间太短或酒精浓度太低，染料未完全洗脱。最常见的技术误差。涂片过厚。
假阴性（应是G⁺却呈G⁻）	脱色过度：脱色时间太长，染料被过度洗脱。培养物太老：老龄G⁺菌细胞壁可能降解，导致脱色。使用抗生素后的细菌。染色操作不当。
染色不均匀	涂片制作不佳，有团块；固定不均匀。
“革兰氏可变性”	某些细菌（如梭菌、芽孢杆菌、痤疮丙酸杆菌）本身染色特性不稳定，可能在同一涂片上同时看到紫色和红色的菌体。

与其他染色法的关系

vs. 抗酸染色：用于鉴别分枝杆菌（如结核杆菌），这类细菌细胞壁含大量脂质，革兰氏染色不易着色，需用强染液和加热。
vs. 吉姆萨染色：主要用于血液寄生虫、细胞内微生物（如立克次体）和血细胞形态观察，与细菌分类目的不同。
vs. 鞭毛/荚膜/芽孢等特殊染色：用于观察细菌的特殊结构，革兰氏染色主要区分细胞壁。

总结

革兰氏染色是连接微生物形态学和其生理病理特性的桥梁。
它不仅仅是一种染色方法，更是一个强大的分类工具。一个多世纪以来，尽管分子诊断技术飞速发展，革兰氏染色因其快速、简便、低成本和高信息量，仍然是全球每个微生物实验室不可替代的基石技术。掌握其原理和精准操作，是每一位微生物检验人员的核心技能。它永远是临床面对疑似细菌感染时，打响的“第一枪”。

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