内参基因

内参基因（英文：Housekeeping Genes, HKGs）是在基因表达分析（如qPCR、RNA-seq）中用于校正样本间差异的参照基因，其表达理论上应恒定不受实验条件影响。然而，大量研究表明不存在“通用内参”，错误选择将导致数据严重偏差。以下是内参基因的系统指南。

1. 表达稳定性：在比较组（如疾病 vs 健康）间表达无显著变化（p > 0.05）。
2. 中等表达丰度：Cq值（qPCR）在15-30循环之间，避免高/低丰度基因的检测误差。
3. 低组织特异性：在目标组织/细胞类型中普遍表达（如肝细胞与神经元用不同内参）。
4. 不受处理影响：对实验干预（药物、缺氧、感染等）不敏感。

最危险操作：直接沿用文献内参而不验证！

1. 实验设计阶段

• 预实验筛选：对3-5个候选内参进行qPCR，用geNorm/NormFinder软件分析稳定性（M值 < 0.5为佳）。
• 多内参联用：至少选择2个功能无关的内参（如代谢基因GAPDH+结构基因ACTB），取几何平均值校正。

2. 不同场景推荐组合

3. 验证方法

• 阳性对照：已知表达恒定的基因（如看家基因EEF1A1）。
• 阴性对照：含RNase的H₂O → 确认无DNA污染。
• 溶解曲线：单一峰形 → 排除引物二聚体/非特异扩增。

1. 阿尔茨海默病研究：用GAPDH校正 → 患者脑组织BDNF表达“假性降低”（实为GAPDH核转位导致胞质RNA减少）。
2. 癌症化疗耐药：用ACTB → 紫杉醇处理组MDR1基因“假性过表达”（实为ACTB降解导致校正失真）。

1. 外源spike-in：添加人工RNA（如SynRNA）到裂解液 → 绝对定量（适用于单细胞测序）。
2. 全局均值归一化：RNA-seq中计算所有基因表达中位数 → 适用大样本量（＞30）。

1. 数据库：
   • RefGenes：收录经验证的组织特异性内参。
   • HKGs-db：癌症模型内参筛选数据库。
2. 分析软件：
   • geNorm（Biogazelle）：计算内参稳定性M值。
   • BestKeeper：基于Cq值标准差自动排名内参。
3. 引物设计：
   • PrimerBank：预验证内参引物序列。

黄金法则： ADFASDFAF23RQ23R
“没有绝对稳定的内参，只有未经验证的错误” —— 每次实验设计必须执行：
1️⃣ 预实验筛选 + 2️⃣ 多内参联用 + 3️⃣ 稳定性验证

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