内参基因
内参基因（英文：Housekeeping Genes, HKGs）是在基因表达分析（如qPCR、RNA-seq）中用于校正样本间差异的参照基因，其表达理论上应恒定不受实验条件影响。然而，大量研究表明不存在“通用内参”，错误选择将导致数据严重偏差。以下是内参基因的系统指南：
内参基因的核心标准
表达稳定性：
在比较组（如疾病 vs 健康）间表达无显著变化（*p* > 0.05）。
中等表达丰度：
Cq值（qPCR）在 15-30循环 之间，避免高/低丰度基因的检测误差。
低组织特异性：
在目标组织/细胞类型中普遍表达（如肝细胞与神经元用不同内参）。
不受处理影响：
对实验干预（药物、缺氧、感染等）不敏感。
常用内参基因及其风险
| 基因 | 全名 | 适用场景 | 常见陷阱 |
|---|---|---|---|
| GAPDH | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 | 一般细胞培养 | 缺氧/癌症中表达↑；核易位致胞质减少 |
| ACTB | β-肌动蛋白 | 组织匀浆（非极性细胞） | 细胞迁移/分化时变化大；易降解 |
| 18S rRNA | 18S核糖体RNA | 低丰度靶基因 | 不受转录调控；与mRNA处理不同步 |
| HPRT1 | 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶 | 脑组织、干细胞 | 嘌呤代谢药物处理后不稳定 |
| PPIA | 亲环蛋白A | 免疫/炎症模型 | 环孢素A处理时表达↓ |
| RPLP0 | 核糖体大亚基蛋白P0 | 肿瘤组织 | 增殖细胞中表达↑ |
| TBP | TATA框结合蛋白 | 发育/分化研究 | 启动子活性受调控 |
| YWHAZ | 14-3-3ζ蛋白 | 神经组织、癌症 | 磷酸化状态影响功能 |
⚠️ 最危险操作：直接沿用文献内参而不验证！
内参选择实战指南
1. 实验设计阶段
预实验筛选：
对3-5个候选内参进行qPCR，用 geNorm / NormFinder 软件分析稳定性（M值 < 0.5 为佳）。多内参联用：
至少选择 2个 功能无关的内参（如代谢基因 GAPDH + 结构基因 ACTB），取几何平均值校正。
2. 不同场景推荐组合
| 研究模型 | 推荐内参组合 | 依据 |
|---|---|---|
| 哺乳动物细胞系 | PPIA + RPLP0 | 高稳定性（Cancer Res, 2019） |
| 脑组织 | YWHAZ + HPRT1 | 神经元特异性低（Sci Rep, 2020） |
| 癌症组织 | TBP + PGK1 | 不受Warburg效应影响（BMC Cancer, 2021） |
| 植物胁迫实验 | EF1α + UBQ5 | 抵抗干旱/盐诱导波动（Plant Methods, 2018） |
| 细菌感染模型 | gyrA + rpoD | 持家基因保守（J Microbiol Methods, 2020） |
3. 验证方法
阳性对照：已知表达恒定的基因（如看家基因 EEF1A1）。
阴性对照：含RNase的H₂O → 确认无DNA污染。
溶解曲线：单一峰形 → 排除引物二聚体/非特异扩增。
内参失效的灾难性案例
阿尔茨海默病研究：
用 GAPDH 校正 → 患者脑组织 BDNF 表达“假性降低”（实为GAPDH核转位导致胞质RNA减少）。
癌症化疗耐药：
用 ACTB → 紫杉醇处理组 MDR1 基因“假性过表达”（实为ACTB降解导致校正失真）。
替代策略：无内参校正
外源spike-in：
添加 人工RNA（如SynRNA）到裂解液 → 绝对定量（适用于单细胞测序）。
全局均值归一化：
RNA-seq中计算所有基因表达中位数 → 适用大样本量（＞30）。
资源工具推荐
数据库：
RefGenes：收录经验证的组织特异性内参。
HKGs-db：癌症模型内参筛选数据库。
分析软件：
geNorm（Biogazelle）：计算内参稳定性M值。
BestKeeper：基于Cq值标准差自动排名内参。
引物设计：
PrimerBank：预验证内参引物序列。
? 黄金法则：
“没有绝对稳定的内参，只有未经验证的错误” —— 每次实验设计必须执行：
1️⃣ 预实验筛选 + 2️⃣ 多内参联用 + 3️⃣ 稳定性验证
附件列表
词条内容仅供参考，如果您需要解决具体问题
（尤其在法律、医学等领域），建议您咨询相关领域专业人士。