敲低

基因敲低（Knockdown, KD）是通过干扰基因表达（非永久性删除）实现部分降低目标蛋白水平的技术，适用于必需基因研究、剂量效应分析及快速功能筛选。以下是技术原理、方法与应用的全方位解析：

一、技术原理与核心方法

1. RNA干扰（RNAi）技术

2. CRISPR干扰（CRISPRi）

• 机制：
  失活dCas9融合转录抑制因子（如KRAB）→结合靶基因启动子区→阻断转录起始。

• 优势：
  ✅ 可逆调控（撤除gRNA恢复表达）
  ✅ 多重基因同时敲低（多gRNA阵列）
  ✅ 无脱靶切割风险（dCas9无核酸酶活性）

3. 反义寡核苷酸（ASO）

• 机制：
  单链DNA/RNA通过碱基配对结合mRNA→触发RNase H降解或阻断翻译。

• 特色：

  • 化学修饰（如PS骨架、2'-MOE）增强稳定性

  • FDA批准药物（如治疗SMA的Nusinersen）

二、实验设计关键策略

1. 靶点选择优化

2. 对照设置

• 阴性对照：

  • 乱序siRNA（Scrambled siRNA）

  • 靶向荧光基因的gRNA（如 EGFP）

• 阳性对照：

  • 已知高效靶点（如 GAPDH siRNA）

3. 效率验证

• mRNA水平：qRT-PCR（推荐TaqMan探针法）

• 蛋白水平：

  • 免疫印迹（WB）

  • 流式细胞术（若为表面蛋白）

  • 荧光报告系统（如敲低 GFP 基因）

三、应用场景与前沿案例

1. 功能筛选

• 全基因组RNAi库：

  • 筛选肿瘤耐药基因（Dharmacon siGENOME库，靶点＞18,000）

• CRISPRi文库：

  • 鉴定必需基因（如K562细胞CRISPRi-v2文库覆盖＞20,000基因）

2. 疾病机制研究

• 神经退行性疾病：

  • HTT 基因ASO敲低→亨廷顿病模型小鼠运动功能改善（Ⅲ期临床中）

• 病毒感染：

  • siRNA靶向SARS-CoV-2 RdRp→降低病毒载量100倍（仓鼠模型）

3. 药物靶点验证

• 剂量效应分析：

  • 梯度敲低 HER2 → 验证曲妥珠单抗的EC₅₀（精准匹配临床响应阈值）

四、技术瓶颈与突破方案

1. 脱靶效应

2. 体内递送挑战

• 器官靶向递送：

  • GalNAc偶联siRNA：肝细胞靶向（如药物Givosiran治疗急性肝卟啉症）

  • LNP包裹mRNA：肌肉注射CRISPRi组分→局部敲低 DMD（杜氏肌营养不良模型）

• 血脑屏障穿透：

  • 聚焦超声开放BBB + 微泡载体递送ASO（猕猴实验成功敲低 BACE1）

3. 瞬时性限制

• 长效RNAi：

  • AAV-shRNA：恒河猴中持续敲低＞2年（靶向 TTR 治疗淀粉样变性）

• 小分子诱导系统：

  • Tet-On调控dCas9-KRAB→口服多西环素控制敲低时长

五、与基因敲除（KO）的核心区别

六、未来方向

1. 智能响应系统

• 疾病微环境激活：

  • MMP2酶切型siRNA前体→肿瘤高表达MMP2释放活性siRNA（Nat. Biotechnol. 2023）

2. 表观遗传敲低

• CRISPRoff升级版：

  • dCas9-DNMT3A/SUV39H1→甲基化/甲基化沉默基因→抑制效率＞95%

3. 人工智能优化

• DeepRNAi：

  • 深度学习预测高效siRNA序列（AUC=0.93）

总结

基因敲低技术凭借可逆性、快速性及低毒性优势，成为功能基因组学和药物开发的基石：
✅ 必需基因研究（避免KO致死）
✅ 临床转化先行者（已上市7款RNAi/ASO药物）
✅ 动态调控利器（光控/小分子诱导系统）

2024里程碑：首款 CRISPRi疗法（NCT06012832）进入Ⅰ期临床，通过AAV递送 *dCas9-KRAB* 靶向 ATXN2 基因，治疗肌萎缩侧索硬化（ALS）。