穿孔膜片钳

穿孔膜片钳
Perforated Patch Clamp

概述（Overview）
穿孔膜片钳是一种全细胞膜片钳记录技术的变体，通过在细胞膜上形成由抗生素微孔构成的通道，从而实现电极内液与细胞质之间的电连续性，同时最大程度地保持细胞质内大分子成分和信号系统的完整性。它是介于细胞贴附式与传统全细胞模式之间的关键技术，旨在克服传统全细胞模式因胞质被“透析”而产生的rundown（衰减）现象。

核心原理（Core Principle）

• 形成微孔： 在电极内液中加入特定的多烯类抗生素（如制霉菌素或两性霉素B）。这些分子嵌入到细胞膜（吉欧姆封接区域内）的脂质双分子层中，聚集成单价离子可通过但大分子无法通过的微孔。

• 实现电学通路： 微孔允许K⁺、Na⁺、Cl⁻等小离子自由通过，形成低电阻通路，使电极能够测量和控制细胞膜电位或电流，如同全细胞模式。

• 保持胞质完整： 大分子物质（如蛋白质、第二信使、核苷酸）被保留在细胞内，从而维持了细胞内环境的稳定性和复杂的信号转导通路。

技术流程（Technical Procedure）

1. 电极制备与灌液： 使用经火焰抛光或未抛光的玻璃微电极。后灌法至关重要：先用不含抗生素的常规内液填充电极尖端（~10-20 μm高度），再用含有抗生素的相同内液填充电极主体。

2. 形成吉欧姆封接： 与细胞接触并施加负压，形成高阻抗封接（>1 GΩ），此步骤与标准膜片钳相同。

3. 等待穿孔： 封接形成后，电极尖端的抗生素分子逐渐扩散至细胞膜并形成微孔。此过程需要数分钟至十数分钟，表现为串联电阻逐渐下降，并趋于稳定。

4. 达到稳定状态： 当串联电阻降至一个稳定且足够低的值（通常<50 MΩ）时，即可开始记录。

主要优点（Major Advantages）

1. 最小化“Rundown”： 这是最主要优势。对于G蛋白偶联受体介导的电流、钙依赖性钾电流、钙通道电流等极易因胞内成分（如ATP、GTP、钙调蛋白）被透析而迅速衰减的信号，穿孔膜片钳能显著延长稳定记录时间（可达数小时）。

2. 维持细胞内钙稳态： 能更好地保持内源性钙缓冲系统和钙库功能，更适合研究钙依赖性过程。

3. 保持信号转导通路完整性： 适用于研究由神经递质、激素等通过第二信使系统调节离子通道的慢速、长时程调制。

4. 减少细胞容积变化： 避免因高渗内液引起的细胞肿胀。

局限性与挑战（Limitations and Challenges）

1. 串联电阻较高且不稳定： R_s通常高于传统全细胞模式（~10-50 MΩ vs ~5-20 MΩ），且可能随时间略有波动，需要更仔细地监测和补偿。

2. 穿孔过程缓慢且不可控： 穿孔需要等待，成功率可能低于传统破膜。微孔形成的速度和数量难以精确控制。

3. 无法向细胞内引入物质： 无法通过电极向细胞内注入染料（如生物胞素进行形态学重构）、钙指示剂、第二信使类似物或酶抑制剂等，限制了部分实验设计。

4. 抗生素的潜在副作用： 高浓度抗生素可能对某些细胞有毒性或非特异性效应。

5. 电容瞬变补偿更复杂： 由于存在多个并联的RC电路（多个微孔），电容瞬变可能呈现多指数成分，补偿更困难。

常用穿孔剂（Common Perforating Agents）

1. 制霉菌素： 最常用，形成直径约0.8 nm的孔，通透单价阴、阳离子，但不通透二价阳离子（如Ca²⁺、Mg²⁺）和大分子。常用浓度：150-300 μg/mL（溶于DMSO）。

2. 两性霉素B： 形成的孔对单价阳离子（K⁺、Na⁺）通透性比对Cl⁻好，且通透少量Ca²⁺。与制霉菌素相比，其对某些电流的rundown保护效果可能更佳，但溶解性和稳定性稍差。常用浓度：240 μg/mL（溶于DMSO）。

3. β-escin： 一种皂苷，能形成更大的非选择性孔，通透性更好（R_s更低），但可能对细胞完整性影响更大。

应用场景（Application Scenarios）
穿孔膜片钳特别适用于以下研究：

• GPCR信号通路： 研究去甲肾上腺素、乙酰胆碱、神经肽等对离子通道的慢速调制。

• 钙依赖性电流： 如BK电流、SK电流、钙激活的氯电流等。

• 代谢调控的通道： 如受ATP/ADP比例调控的ATP敏感钾通道。

• 分泌细胞的电生理： 研究膜电容变化（胞吐）时，需要完整的分泌机制。

• 长期稳定记录： 任何需要长时间（>30分钟）稳定记录且易发生rundown的实验。

与其它模式的比较（Comparison with Other Configurations）

参考文献（References）

1. Horn, R., & Marty, A. (1988). Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. The Journal of General Physiology, 92(2), 145-159.（开创性论文，首次使用制霉菌素穿孔膜片钳）

2. Rae, J., Cooper, K., Gates, P., & Watsky, M. (1991). Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. Journal of Neuroscience Methods, 37(1), 15-26.（引入两性霉素B穿孔）

3. Akaike, N., & Harata, N. (1994). Nystatin perforated patch recording and its applications to analyses of intracellular mechanisms. Japanese Journal of Physiology, 44(5), 433-473.（详尽的综述）

4. Axon Guide 或 HEKA手册中关于穿孔膜片钳的实践章节。

5. Kyrozis, A., & Reichling, D. B. (1995). Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration. Journal of Neuroscience Methods, 57(1), 27-35.（使用革兰霉素记录Cl⁻依赖电流）

总结
穿孔膜片钳通过巧妙地在细胞膜上建立选择性离子通道，实现了电学通路与化学完整性的良好平衡。它是在研究涉及复杂细胞内信号转导的长时程生理过程时，不可替代的关键技术。尽管操作更具挑战性，但其在维持生理相关性和数据稳定性方面的巨大优势，使其成为现代电生理学家工具箱中的重要组成部分。