血凝抑制试验

血凝抑制试验（Hemagglutination Inhibition Test, HI试验）是一种利用特异性抗体阻断病毒血凝素（HA）与红细胞结合的血清学检测方法。某些病毒（如流感病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒等）表面含有血凝素蛋白，能识别并结合人或动物红细胞表面的唾液酸受体，导致红细胞发生凝集，这一现象称为血凝现象（hemagglutination）。当病毒与相应抗体（通常来自感染或免疫后的血清）预先孵育时，抗体与病毒表面HA结合，空间位阻或构象变化使HA无法与红细胞受体结合，从而抑制血凝。HI试验的本质是抗原-抗体中和反应的可视化体现，其灵敏性高、特异性强，是病毒学研究和临床诊断的重要工具。

血凝现象最早由Hirst于1941年发现，他观察到流感病毒能够凝集鸡红细胞，并随后发现免疫血清可抑制这一现象。1942年，Hirst正式建立了血凝抑制试验，并将其用于流感病毒分型和流行病学研究。此后，随着副粘病毒（如新城疫病毒）和黄病毒（如日本脑炎病毒）的发现，HI试验的应用范围不断扩大。20世纪50年代，世界卫生组织（WHO）将HI试验作为流感病毒抗原性分析的标准方法之一。至今，HI试验仍是全球流感监测网络（GISRS）的核心技术之一，用于监测新型流感病毒的出现及疫苗株选择。

病毒抗原

待测病毒通常需先经鸡胚培养、细胞培养或鼠脑传代等方法增殖，并通过血凝试验（HA试验）测定其血凝效价。HI试验所用病毒抗原一般调整为4个血凝单位（4 HAU）/25 μL或8 HAU/50 μL。

红细胞

常用红细胞种类包括鸡、豚鼠、鹅、人（O型）等，选择依据为病毒对不同红细胞的凝集特性。例如，流感病毒多使用鸡或豚鼠红细胞；副粘病毒常用鸡红细胞；黄病毒常用鹅红细胞。红细胞需用生理盐水或磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，配制成0.5%~1%（v/v）悬液。

待检血清

血清需经处理去除非特异性抑制物（如非特异性血凝素、β-抑制剂等）。常用方法包括：受体破坏酶（RDE）处理、胰酶-高碘酸盐处理、加热灭活（56℃, 30 min）等。处理后血清需用红细胞吸附去除对红细胞的天然凝集。

其他试剂

生理盐水（0.9% NaCl）、PBS、微量滴定板、多道移液器、孵育箱等。

血凝效价测定（HA试验）

将病毒在微量滴定板中进行倍比稀释，加入等量红细胞悬液，室温或4℃孵育30-60分钟，观察红细胞凝集模式。以最高稀释度出现完全凝集者为一个血凝单位（HAU）。用于HI试验的病毒抗原需稀释至4 HAU/25 μL。

血清处理

待测血清按1:10稀释后，加入等量RDE（如霍乱弧菌滤液），37℃水浴16-18小时，再56℃灭活30分钟；或采用胰酶-高碘酸盐法：血清1:5稀释，加等量1%胰酶，56℃ 30 min，再加1/5体积的0.11 M高碘酸钠，室温15 min，加1/5体积1%甘油终止反应。处理后血清加等量红细胞悬液，4℃吸附1小时以去除非特异性凝集。

HI试验操作

在96孔V型微量滴定板中进行：每孔加入25 μL PBS或生理盐水，在第一孔加入25 μL处理后的血清，倍比稀释；每孔加入25 μL稀释好的病毒抗原（含4 HAU），振荡混匀，室温孵育15-30分钟；每孔加入25 μL红细胞悬液（0.5%-1%），振荡混匀，4℃或室温孵育30-60分钟；观察结果。以完全抑制血凝的最高血清稀释度的倒数为HI抗体滴度。

凝集模式与判定标准

红细胞在V型板中沉降至孔底呈点状者为凝集抑制（阳性），呈薄膜状铺于孔底者为血凝（阴性）。通常以1:10作为诊断阳性阈值，但不同疾病和疫苗评价标准有所差异。

影响因素

• 红细胞种类与浓度：不同病毒对不同红细胞凝集谱不同，需预先试验选择。
• 非特异性抑制物：血清中存在的β-抑制剂、α-抑制剂等可通过RDE或加热处理去除。
• 温度与孵育时间：通常4℃孵育可减少红细胞沉降，提高灵敏度。
• 病毒抗原用量：过量抗原（>8 HAU）会降低试验灵敏度，过少则影响可重复性。

病毒鉴定与分型

利用型特异性或亚型特异性抗体，通过HI试验可鉴别病毒型别和亚型。例如，甲型流感病毒根据HA和NA抗原性分为H1-H18和N1-N11亚型，HI试验是区分H1N1、H3N2等亚型的标准方法。

流行病学调查

通过检测人群或动物群体血清中HI抗体水平，了解既往感染史、病毒传播动态及免疫保护屏障。WHO全球流感监测网络每年采集大量血清样本进行HI检测，为疫苗株推荐提供依据。

疫苗免疫效果评估

疫苗接种前后采集血清，检测HI抗体转换率、几何平均滴度（GMT）和血清保护率。通常认为HI滴度≥1:40具有保护作用（针对流感）。

病毒抗原变异监测

利用HI试验比较不同毒株与参考抗血清的反应模式，可检测抗原漂移或抗原转换。例如，季节性流感病毒HI抗原图谱分析可发现新的抗原变异株。

• 非特异性抑制物干扰：血清中某些脂蛋白、酶抑制剂等可模拟或抑制血凝，需严格处理。
• 血细胞种类限制：某些病毒（如新甲型流感H7N9）对红细胞凝集能力弱，需特殊处理红细胞或使用其他方法。
• 不能区分抗体亚类：无法区分IgG、IgM或IgA，不适用于早期感染诊断（除非检测特异性IgM）。
• 重复性受操作影响：抗原用量、细胞浓度、孵育温度等需标准化，否则结果变异大。
• 交叉反应：不同亚型间存在部分交叉反应，尤其在流感病毒中可能干扰分型。

随着分子生物学和免疫学技术发展，HI试验逐步与自动化、微量化技术结合。例如，基于红细胞凝集图案的自动判读系统（如图像分析软件）提高了通量和客观性。此外，利用重组HA蛋白代替全病毒抗原可降低生物安全风险。在新冠疫情期间，基于血凝的替代方法（如SARS-CoV-2刺突蛋白介导的红细胞凝集抑制试验）也曾被探索。未来，HI试验仍将在流感防控、新发传染病监测和疫苗评价中占据重要地位。

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