基因表达分析

基因表达分析（英文：Gene expression analysis）是指通过实验和计算方法，对细胞或组织中基因（英文：Gene）的活性（即表达水平）进行定性或定量研究的过程。其核心目标是了解在特定生物学条件（如发育阶段、疾病状态、环境刺激）下，哪些基因被激活（上调）、抑制（下调），以及它们的表达模式如何调控生命活动。该领域是现代功能基因组学（英文：Functional genomics）和系统生物学（英文：Systems biology）的基石。

分析层次与技术

基因表达可以在多个层次上进行测量，主要技术包括：

1. 转录组水平（mRNA丰度）：

   • 微阵列（英文：Microarray）：通过杂交原理，同时检测数万个基因的预设探针信号。是第二代主流技术。

   • RNA测序（英文：RNA sequencing， RNA-Seq）：基于高通量测序，直接测定并量化所有RNA转录本（包括未知转录本）。是目前的金标准和主流技术。

   • 定量逆转录聚合酶链式反应（英文：Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction， qRT-PCR）：用于对少数特定基因进行高灵敏度、高精度的绝对或相对定量验证。

2. 蛋白质水平（蛋白质丰度与修饰）：

   • 蛋白质组学技术，如质谱法（英文：Mass spectrometry）和蛋白质微阵列，用于直接研究基因的功能执行者——蛋白质。

3. 表现水平（功能或表型）：

   • 通过基因敲除（英文：Gene knockout）、RNA干扰（英文：RNA interference）等技术，研究基因失活后的细胞或表型变化。

表1：主流转录组分析技术比较

核心分析流程（以RNA-Seq为例）

现代基因表达分析是一个从原始数据到生物学洞见的数据科学流程：

1. 实验设计与测序：设计生物学重复，进行RNA提取、文库构建和上机测序，产生原始测序序列文件（FASTQ格式）。

2. 质量控制与预处理：使用工具（如FastQC, Trimmomatic）评估并去除低质量序列和接头。

3. 序列比对：将清理后的序列比对到参考基因组（如使用HISAT2, STAR）或转录组。

4. 表达定量：统计比对到每个基因或转录本上的序列读数（Read counts），生成表达矩阵（基因 × 样本）。

5. 标准化：消除技术偏差（如测序深度、基因长度差异），常用方法有TPM、FPKM，或用于差异分析的如DESeq2的标准化、edgeR的TMM。

6. 差异表达分析（英文：Differential expression analysis）：使用统计模型（如DESeq2, edgeR, limma-voom）鉴定在两个或多个条件间表达水平发生显著变化的基因。

7. 功能与通路富集分析：对差异表达基因集合，进行基因本体论（英文：Gene Ontology， GO）和京都基因与基因组百科全书（英文：KEGG）通路分析，揭示其相关的生物学过程、分子功能和通路。

8. 高级分析与可视化：

   • 聚类分析（如层次聚类）与热图（英文：Heatmap）绘制，发现表达模式相似的基因或样本组。

   • 主成分分析（英文：Principal Component Analysis， PCA），评估样本间整体相似性和批次效应。

   • 构建基因共表达网络（英文：Gene co-expression network），挖掘调控模块。

主要应用领域

1. 基础生物学研究：解析发育、分化、细胞周期、应激反应等过程的调控机制。

2. 疾病生物学与生物标志物发现：比较健康与患病组织（如肿瘤 vs. 癌旁），寻找疾病标志物（英文：Biomarkers）和药物靶点。

3. 药物开发与毒理学：评估药物或化合物对全基因组表达的影响（药物基因组学）。

4. 精准医学：对癌症等疾病进行分子分型，指导预后和个性化治疗（如乳腺癌的PAM50分型）。

5. 农业与植物科学：研究作物抗逆性、产量性状的形成机制。

挑战与前沿

• 数据标准化与批次效应校正：不同实验批次和技术平台带来的系统性偏差。

• 单细胞RNA测序分析（英文：Single-cell RNA-seq）：在单个细胞分辨率下解析细胞异质性，带来数据分析的革新（如细胞类型鉴定、轨迹推断）。

• 空间转录组学（英文：Spatial transcriptomics）：在组织原位保留空间位置信息的情况下测量基因表达。

• 多组学整合（英文：Multi-omics integration）：将转录组数据与基因组、表观基因组、蛋白质组数据结合，构建更全面的调控网络。

• 人工智能的应用：使用深度学习模型进行表达预测、特征提取和疾病分类。

常用软件与数据库

• 分析流程：Galaxy（在线平台），Nextflow/Snakemake（流程管理）。

• 差异表达工具：DESeq2, edgeR, limma。

• 富集分析工具：clusterProfiler, DAVID, Metascape。

• 数据库：NCBI GEO, EBI ArrayExpress（存储原始数据），Gene Ontology, KEGG（功能注释）。

参考文献

1. Trapnell, C., et al. (2012). Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nature Protocols, 7(3), 562–578. （早期RNA-Seq分析的经典流程指南）

2. Love, M. I., Huber, W., & Anders, S. (2014). Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology, 15(12), 550. （目前最广泛使用的差异表达分析工具之一的方法学论文）

3. Subramanian, A., et al. (2005). Gene set enrichment analysis: A knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the National Academy of Sciences, 102(43), 15545-15550. （开创性的功能富集分析方法GSEA的论文）

4. Wagner, G. P., Kin, K., & Lynch, V. J. (2012). Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples. Theory in Biosciences, 131(4), 281–285. （讨论RNA-Seq定量标准化的重要议题）

5. Conesa, A., et al. (2016). A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biology, 17, 13. （提供了从原始数据到结果的RNA-Seq数据分析最佳实践的综合指南）