批次效应
批次效应（英文：Batch effect）是指在高通量实验和组学数据分析中，由于非生物学的技术性因素在不同实验批次间引入的系统性变异。这些因素会掩盖或混淆真实的生物学信号，是导致数据不可重复和错误发现的主要技术挑战之一。批次效应广泛存在于微阵列、RNA测序、蛋白质组学和代谢组学等实验中。
定义与核心特征
系统性：并非随机噪声，而是在特定批次内所有样本间产生一致偏移的模式。
非生物学来源：由实验过程的差异引起，而非所研究的生物条件本身。
可叠加性：可能叠加在真实的生物学信号之上，干扰数据的解释。
普遍性：在多中心、长时间跨度或大规模的研究中几乎无法完全避免。
主要来源
批次效应产生于实验流程的几乎每一个环节：
样本制备：不同操作者、不同时间点进行RNA/DNA提取，试剂盒批次不同，提取效率差异。
实验处理：样本处理在不同日期进行，仪器校准状态变化（如离心机温度、pH计偏差）。
检测平台：
微阵列：不同芯片批次、杂交条件、扫描仪的差异。
高通量测序：不同测序运行批次、不同流动槽、不同文库制备试剂、测序平台（如 Illumina HiSeq 与 NovaSeq）间的系统性差异。
环境因素：实验室温度、湿度波动。
表1：批次效应与生物学变异的对比
| 特征 | 批次效应 | 生物学变异 |
|---|---|---|
| 来源 | 技术性、实验流程 | 遗传、生理、环境、处理条件 |
| 模式 | 与实验批次高度相关 | 与生物表型或条件相关 |
| 目标 | 需要被识别并校正或消除的干扰信号 | 研究的核心目标信号 |
| 识别方法 | 无监督分析（如PCA）中样本按实验批次聚类 | 无监督分析中样本按生物学条件聚类 |
识别与诊断
在数据分析前，识别批次效应至关重要：
无监督可视化：
主成分分析（英文：Principal Component Analysis， PCA）：是最有效的诊断工具。如果样本在第一或第二主成分上按实验日期、处理批次或测序通道（而非生物学条件）清晰分离，则表明存在强烈的批次效应。
层次聚类热图：检查样本是否主要按技术批次而非实验组别聚类。
有监督分析：使用方差分析等方法，量化各主成分或基因表达量与批次变量的关联强度。
校正方法与策略
1. 实验设计阶段（预防）
随机化：将不同实验条件的样本随机分配到各个实验批次中，使批次效应与关注条件不相关（混杂）。
平衡设计：确保每个批次内包含所有实验条件的样本，且比例均衡。
引入对照：使用参考样本或混合样本，在每批实验中运行，用于监控和校正批次间差异。
2. 数据分析阶段（校正）
当预防不足时，需采用计算校正方法：
基于线性模型的校正：
limma包中的removeBatchEffect()函数：在拟合线性模型后，从表达数据中减去估计出的批次效应。适用于下游差异表达分析。纳入协变量：在统计模型（如DESeq2、edgeR的广义线性模型）中直接将“批次”作为协变量。这是最直接和推荐的方法之一。
基于经验的校正：
ComBat（及其变体
sva包中的ComBat_seq用于计数数据）：使用经验贝叶斯方法估计批次效应，并进行调整。能有效处理小批次情况。奇异值分解（英文：Singular Value Decomposition， SVD）或因子分析：估计并移除与批次相关的主要变异成分。
标准化方法：某些标准化方法（如TMM、RLE）可在一定程度上缓解批次间的组成差异。
挑战与注意事项
过度校正风险：校正方法可能意外移除部分真实的生物学信号，尤其是当批次与生物学条件轻微相关时。
复杂批次结构：存在多个交叉或嵌套的批次变量时，校正更为复杂。
新批次预测：对于需要将新样本数据与已有批次数据合并分析的情况（如临床诊断模型），需谨慎处理批次转移问题。
方法选择：没有一种方法适用于所有情况，需根据数据类型（连续值/计数）、批次结构、与生物学条件的关联性进行选择和评估。
主要应用领域
批次效应校正对以下领域的数据整合与可重复性至关重要：
多中心临床研究：整合来自不同医院或实验室的样本数据。
大型公共数据库挖掘：整合基因表达综合数据库（英文：Gene Expression Omnibus， GEO）中不同研究、不同平台的数据进行元分析。
纵向研究：样本在不同时间点收集和检测。
大型 consortia 项目：如癌症基因组图谱（英文：The Cancer Genome Atlas， TCGA）、ENCODE等项目，必须系统处理来自多个中心的批次效应。
参考文献
Leek, J. T., et al. (2010). Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data. Nature Reviews Genetics, 11(10), 733–739. （关于批次效应问题及其影响的里程碑式综述）
Johnson, W. E., Li, C., & Rabinovic, A. (2007). Adjusting batch effects in microarray expression data using empirical Bayes methods. Biostatistics, 8(1), 118–127. （提出了广泛使用的ComBat校正方法的原始论文）
Ritchie, M. E., et al. (2015). limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research, 43(7), e47. （介绍了
limma包及其removeBatchEffect函数，是差异分析和批次校正的核心工具）Zhang, Y., Parmigiani, G., & Johnson, W. E. (2020). ComBat-seq: batch effect adjustment for RNA-seq count data. NAR Genomics and Bioinformatics, 2(3), lqaa078. （将ComBat方法扩展到RNA-Seq计数数据的论文）
Gagnon-Bartsch, J. A., & Speed, T. P. (2012). Using control genes to correct for unwanted variation in microarray data. Biostatistics, 13(3), 539–552. （提出了使用对照基因进行批次校正的RUV方法）
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