iTRAQ

iTRAQ试剂属于等重异位标签（英文：Isobaric tag）。其核心设计在于，不同通道的完整试剂分子质量完全相同，但它们在串联质谱（MS/MS）中碎裂后会产生质量不同的报告离子。 ADSFAEQWER353423413434

• 试剂结构：每个iTRAQ分子由三部分组成：
  1. 报告基团：在MS/MS中碎裂产生，质量为113-121 Da（4/8plex）或更大范围。不同通道的报告离子质量不同，用于定量。
  2. 平衡基团：其质量与报告基团互补，确保所有通道的完整试剂分子总质量相同（如4/8plex均为305 Da）。
  3. 肽反应基团：通常是N-羟基琥珀酰亚胺酯，与肽段N-末端及赖氨酸侧链的伯胺发生共价反应。
• 工作流程：
  1. 样品制备与标记：将不同条件下的蛋白质样品分别提取、还原、烷基化并酶解（通常用胰蛋白酶）成肽段。每个样品分别与一种特定通道的iTRAQ试剂反应。
  2. 等量混合：将所有标记后的样品等比例混合。
  3. LC-MS/MS分析：混合样品经高效液相色谱分离后进行串联质谱分析。
     • MS1扫描：检测肽段母离子。由于等重设计，来自不同样品的同一肽段表现为单一的、合并的峰，简化了MS1谱图。
     • MS2扫描：选择肽段母离子进行碰撞诱导解离。断裂主要发生在报告基团与平衡基团的连接键上，产生：a. 报告离子：一组低质量数的报告离子，其相对强度直接对应于原始样品中该肽段的相对丰度。b. 肽段碎片离子：用于肽段序列鉴定。
  4. 数据解析：通过专业软件（如ProteinPilot， Proteome Discoverer）解析MS2谱图，根据碎片离子鉴定蛋白质，并根据各通道报告离子的强度进行肽段及蛋白质的定量。

1. 高通量多重定量：单次实验可同时比较4个或8个样品，大大提高了实验通量并减少了批次效应。
2. 高定量精度：所有样品在质谱分析前已混合，经历完全相同的后续处理流程，技术变异小。
3. 提高鉴定效率：等重设计避免了MS1谱图的复杂性，可提高母离子选择的灵敏度和肽段鉴定率。
4. 适用性广：适用于任何类型的蛋白质样品，包括细胞、组织、体液（血清、尿液）等。

表1：iTRAQ与相关定量技术的比较 ADSFAEQWER353423413434

主要挑战：报告离子压缩/比值压缩

• 问题：在MS2碎裂中，与目标肽段共同选择、共同碎裂的干扰离子（如同质异位肽段、共同洗脱肽段）会贡献背景信号到报告离子通道中，导致报告离子强度比被压缩向1:1，从而严重低估真实的定量差异。这是所有等重标记技术（包括TMT）面临的共同挑战。
• 缓解方案：
  • 提高分离度：使用更长的色谱梯度或二维分离，减少共洗脱肽段。
  • 提高碎裂特异性：如使用更高能碰撞解离或电子转移解离。
  • 数据校正：开发软件算法进行事后校正（效果有限）。

1. 原始数据处理：使用AB Sciex的ProteinPilot软件或Thermo Fisher的Proteome Discoverer进行数据库搜索和定量提取。
2. 定量数据归一化：基于所有肽段的总和或中位数进行全局归一化，以校正混合时的误差。
3. 统计学分析：使用统计软件（如R语言的limma包）进行差异蛋白质分析，并进行多重检验校正（如控制错误发现率）。
4. 生物信息学解读：进行功能富集分析、通路分析等。

• 疾病生物标志物发现：比较癌组织与癌旁组织、疾病患者与健康对照的血清/血浆样本。
• 药物作用机制研究：分析药物处理前后细胞或组织的蛋白质组动态变化。
• 翻译后修饰分析：与磷酸化肽段富集等技术联用，进行修饰组学的多重定量。
• 植物与微生物蛋白质组学：研究非哺乳动物系统的蛋白质表达调控。

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