iTRAQ
iTRAQ（英文：Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation），中文常译为相对与绝对定量同重标签，是一种用于高通量定量蛋白质组学（英文：Quantitative proteomics）的体外、多重化学标记技术。它利用一组具有相同质量但结构不同的化学试剂，对来自不同实验条件的蛋白质酶解肽段进行标记，使得最多8个样品可以在单次质谱分析中被同时鉴定和定量，显著提高了通量和定量精度。
核心原理
iTRAQ试剂属于等重异位标签（英文：Isobaric tag）。其核心设计在于，不同通道的完整试剂分子质量完全相同，但它们在串联质谱（MS/MS）中碎裂后会产生质量不同的报告离子。
试剂结构：每个iTRAQ分子由三部分组成：
报告基团：在MS/MS中碎裂产生，质量为113-121 Da（4/8plex）或更大范围（更新的试剂）。不同通道的报告离子质量不同，用于定量。
平衡基团：其质量与报告基团互补，确保所有通道的完整试剂分子总质量相同（如4/8plex均为305 Da）。
肽反应基团：通常是N-羟基琥珀酰亚胺酯，与肽段N-末端及赖氨酸侧链的伯胺发生共价反应。
工作流程：
样品制备与标记：将不同条件下的蛋白质样品分别提取、还原、烷基化并酶解（通常用胰蛋白酶）成肽段。每个样品分别与一种特定通道的iTRAQ试剂反应。
等量混合：将所有标记后的样品等比例混合。
LC-MS/MS分析：混合样品经高效液相色谱分离后进行串联质谱分析。
MS1扫描：检测肽段母离子。由于等重设计，来自不同样品的同一肽段表现为单一的、合并的峰，简化了MS1谱图。
MS2扫描：选择肽段母离子进行碰撞诱导解离。断裂主要发生在报告基团与平衡基团的连接键上，产生：
a. 报告离子：一组低质量数的报告离子，其相对强度直接对应于原始样品中该肽段的相对丰度。
b. 肽段碎片离子：用于肽段序列鉴定。
数据解析：通过专业软件（如ProteinPilot， Proteome Discoverer）解析MS2谱图，根据碎片离子鉴定蛋白质，并根据各通道报告离子的强度进行肽段及蛋白质的定量。
技术优势
高通量多重定量：单次实验可同时比较4个或8个样品（早期版本为4-plex，后来发展为8-plex），大大提高了实验通量并减少了批次效应。
高定量精度：所有样品在质谱分析前已混合，经历完全相同的后续处理流程，技术变异小。
提高鉴定效率：等重设计避免了MS1谱图的复杂性，可提高母离子选择的灵敏度和肽段鉴定率。
适用性广：适用于任何类型的蛋白质样品，包括细胞、组织、体液（血清、尿液）等。
表1：iTRAQ与相关定量技术的比较
| 技术 | 标记原理 | 最大通量 | 标记阶段 | 主要优势 | 主要局限 |
|---|---|---|---|---|---|
| iTRAQ (8-plex) | 体外化学标记（等重异位标签） | 8重 | 酶解后（肽段水平） | 通量较高、精度高、样本兼容性好 | 存在“报告离子压缩”，成本较高 |
| TMT (TMTpro) | 体外化学标记（等重异位标签） | 16-18重 | 酶解后（肽段水平） | 通量更高，报告离子质量范围更优，压缩效应解决方案更多 | 成本高，原理性压缩问题同样存在 |
| SILAC | 体内代谢标记 | 通常2-3重 | 细胞培养期（蛋白质合成时） | 定量精准度最高（金标准） | 仅限可培养细胞，通量低 |
| Label-Free | 非标记 | 理论上无限 | 无 | 成本最低，样本处理简单 | 精度低，批次效应需严格校正 |
挑战与局限性
主要挑战：报告离子压缩/比值压缩
问题：在MS2碎裂中，与目标肽段共同选择、共同碎裂的干扰离子（如同质异位肽段、共同洗脱肽段）会贡献背景信号到报告离子通道中，导致报告离子强度比被压缩向1:1，从而严重低估真实的定量差异。这是所有等重标记技术（包括TMT）面临的共同挑战。
缓解方案：
提高分离度：使用更长的色谱梯度或二维分离，减少共洗脱肽段。
提高碎裂特异性：如使用更高能碰撞解离或电子转移解离。
数据校正：开发软件算法进行事后校正（效果有限）。
数据分析流程
原始数据处理：使用AB Sciex的ProteinPilot软件（专为iTRAQ优化）或Thermo Fisher的Proteome Discoverer（需安装iTRAQ插件）进行数据库搜索和定量提取。
定量数据归一化：基于所有肽段的总和或中位数进行全局归一化，以校正混合时的误差。
统计学分析：使用统计软件（如R语言的
limma包）进行差异蛋白质分析，并进行多重检验校正（如控制错误发现率）。生物信息学解读：进行功能富集分析、通路分析等。
应用领域
疾病生物标志物发现：比较癌组织与癌旁组织、疾病患者与健康对照的血清/血浆样本。
药物作用机制研究：分析药物处理前后细胞或组织的蛋白质组动态变化。
翻译后修饰分析：与磷酸化肽段富集等技术联用，进行修饰组学的多重定量。
植物与微生物蛋白质组学：研究非哺乳动物系统的蛋白质表达调控。
参考文献
Ross, P. L., et al. (2004). Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & Cellular Proteomics, 3(12), 1154-1169. （首次报道iTRAQ技术（4-plex）的里程碑论文）
Choe, L., et al. (2007). 8-plex quantitation of changes in cerebrospinal fluid protein expression in subjects undergoing intravenous immunoglobulin treatment for Alzheimer's disease. Proteomics, 7(20), 3651-3660. （展示了8-plex iTRAQ在临床样本中的应用）
Ow, S. Y., et al. (2009). iTRAQ underestimation in simple and complex mixtures: "The good, the bad and the ugly". Journal of Proteome Research, 8(11), 5347-5355. （深入探讨了iTRAQ定量中比值压缩的问题及其影响）
Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., & Warscheid, B. (2007). Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics, 7(3), 340-350. （一篇关于iTRAQ技术原理与应用的详细综述）
AB Sciex. (2012). ProteinPilot™ Software for Protein Identification and iTRAQ Quantitation. Application Guide. （iTRAQ配套主流分析软件的官方指南，提供了标准操作流程）
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