熔解曲线

熔解曲线，英文名 Melting Curve，是指在温度匀速升高的过程中，监测DNA双链分子（或DNA-RNA杂交分子）解链成为单链状态时，其物理化学性质（如吸光度或荧光强度）随温度变化的函数曲线。在分子生物学领域，特别是实时定量PCR和高分辨率熔解分析中，熔解曲线分析是一种至关重要的非探针依赖技术，用于验证PCR产物的特异性、进行基因分型以及评估核酸的序列变异。

核心原理

双链DNA通过氢键和碱基堆积力维持其稳定的双螺旋结构。当温度升高时，这些作用力被破坏，双链会发生可逆的解离，即“熔解”成两条单链。

• 熔解温度：定义为一个DNA双链群体中，有50%的分子发生解链时所对应的温度，称为Tm值。Tm值是DNA双链稳定性的核心指标。

• 监测参数：

  1. 紫外吸收：DNA双链在260 nm处的吸光度低于两条游离的单链。因此，在升温过程中，随着双链解开，溶液的A260吸光度会显著增加（即增色效应）。这是传统测量Tm值的方法。

  2. 荧光强度（在qPCR中广泛应用）：使用能特异性结合双链DNA的饱和荧光染料（如SYBR Green I, EvaGreen）。当染料结合在双链DNA上时，荧光信号强；当双链解离，染料游离后，荧光信号急剧下降。通过监测荧光强度随温度升高的下降过程，即可得到熔解曲线。

在实时定量PCR中的应用与分析

在SYBR Green I染料法qPCR结束后，立即运行熔解曲线分析，是判断扩增产物特异性的标准步骤。

标准分析流程：

1. PCR结束：完成所有扩增循环。

2. 升温解链：仪器缓慢、匀速地升高温度（例如，从60°C升至95°C，每升高0.1-0.5°C采集一次荧光信号）。

3. 数据获取：仪器记录每个温度点对应的荧光强度（通常为负的一阶导数信号，即-d(F)/dT）。

4. 生成曲线：

   • 原始熔解曲线：以温度为横坐标，荧光强度为横坐标，表现为一条随着温度升高、荧光值从高平台骤降到低平台的“S”形曲线。

   • 熔解峰图：对原始熔解曲线求负的一阶导数，以-d(F)/dT为纵坐标。该曲线上的尖峰即代表熔解事件，峰顶对应的温度即为Tm值。

结果解读：

• 单一、尖锐的熔解峰：通常表明PCR扩增产物是单一的、特异的，无非特异性产物或引物二聚体干扰。

• 多个熔解峰：

  • 主峰之外的较低Tm值小峰：通常是引物二聚体的峰（因其长度短，Tm值低）。

  • 多个相近的峰：可能表明存在非特异性扩增产物或长度、序列不同的目标产物。

• Tm值异常：与预期Tm值不符，可能提示产物序列存在突变、引物错配或发生了污染。

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高分辨率熔解曲线分析

高分辨率熔解曲线分析，是熔解曲线技术的重大发展，可用于扫描未知突变和基因分型。

• 核心技术改进：

  1. 使用饱和染料：如LC Green, EvaGreen。这些染料不抑制PCR，且在熔解过程中不会发生重排，能精确反映DNA的真实熔解行为。

  2. 高精度温度控制与检测：仪器能以更小的温度增量（如0.01°C/点）进行升温和数据采集，获得超高分辨率的熔解曲线。

• 应用原理：DNA序列的微小差异（如单碱基突变、插入缺失）会改变其双链的稳定性，从而导致Tm值的细微偏移或熔解曲线形状的特征性变化。HRM通过比较待测样品与野生型标准品的熔解曲线形态，即可区分不同的基因型（纯合野生型、杂合型、纯合突变型），而无需使用序列特异性探针。

主要应用领域

1. 实时定量PCR产物特异性验证：在SYBR Green I法中，是必需的质控步骤。

2. 基因分型与突变扫描：

   • SNP分型：通过HRM可快速、低成本地区分不同的等位基因。

   • 突变筛查：在遗传病诊断、癌症基因检测中，用于扫描特定基因区域的未知突变。

   • 甲基化分析：通过亚硫酸氢盐处理后的DNA序列差异，HRM可区分甲基化与非甲基化状态。

3. 微生物鉴定：基于不同物种特定基因（如16S rRNA）的熔解曲线差异，可对细菌进行快速鉴定。

4. 转基因成分检测：鉴别不同转基因事件的特征序列。

5. 核酸杂交分析：评估探针与靶序列结合的稳定性。

优势与局限性

优势

• 特异性判断工具：快速、直观地评估PCR扩增是否纯净。

• 非探针依赖：HRM无需昂贵的荧光探针或额外的杂交步骤，成本低廉。

• 闭管操作：减少污染风险。

• 高灵敏度：HRM能检测到单碱基的差异。

• 高通量：适合96或384孔板分析。

局限性

• 非定量：主要用于定性分析（分型、验证），本身不用于精确定量。

• 对仪器要求高：HRM需要专门的实时定量PCR仪或高分辨率熔解分析模块。

• 可能受多种因素影响：PCR产物长度、盐离子浓度、染料饱和度等均会影响熔解曲线，需要严格的实验条件控制。

• 确定突变位置能力有限：能判断有无序列变异，但通常不能直接确定突变的具体位置和类型，需要测序确认。

参考文献

1. 熔解曲线基本理论与应用：Ririe, K. M., et al. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 1997, 245(2): 154-160. (首次将熔解曲线分析应用于PCR产物特异性鉴定).

2. 高分辨率熔解分析奠基工作：Wittwer, C. T., et al. High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen. Clinical Chemistry. 2003, 49(6): 853-860. (系统阐述了HRM技术的原理和应用).

3. HRM在突变扫描中的全面综述：Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. 2007, 8(6): 597-608. (详细介绍了HRM在诊断中的应用).

4. 染料与实验条件优化：Gudnason, H., et al. Comparison of multiple DNA dyes for real-time PCR: effects of dye concentration and sequence composition on DNA amplification and melting temperature. Nucleic Acids Research. 2007, 35(19): e127. (比较了不同染料对熔解曲线分析的影响).

5. MIQE指南中的熔解曲线：Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 2009, 55(4): 611-622. (在qPCR实验报告标准中明确了熔解曲线分析的必要性).