逆转录定量PCR

逆转录定量PCR，英文名 Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction，通常缩写为 RT-qPCR（有时也写作qRT-PCR）。它是一种将逆转录与实时定量PCR相结合的强大分子生物学技术，用于检测和精确定量样品中特定的RNA分子（尤其是信使RNA）的含量。作为基因表达分析的金标准，RT-qPCR在基础研究、临床诊断、生物技术和药物开发等领域具有不可替代的核心地位。

核心原理与技术流程

RT-qPCR的核心目标是将不稳定的RNA模板（目标mRNA）转化为稳定的互补DNA，然后利用实时定量PCR技术对cDNA进行扩增和定量，从而间接反映原始RNA样本中特定转录本的丰度。

标准两步法流程

1. 第一步：逆转录

   • 目的：以提取的总RNA（或经过纯化的mRNA）为模板，利用逆转录酶和引物，合成与之互补的第一链cDNA。

   • 关键组分：

     • 逆转录酶：常用莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶或禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶。

     • 引物：

       • Oligo(dT)引物：与mRNA的3‘端poly(A)尾巴结合，主要逆转录带有poly(A)尾的mRNA。

       • 随机六聚体引物：随机结合于RNA模板的多个位点，可逆转录所有RNA（包括rRNA、tRNA、mRNA），适合降解的RNA样本。

       • 序列特异性引物：针对特定目标mRNA设计，特异性最高，但一次反应只能合成一种cDNA。

   • 产物：RNA-DNA杂交链，随后逆转录酶被灭活或通过加热使cDNA释放。

2. 第二步：实时定量PCR

   • 目的：以上一步合成的cDNA库为模板，使用针对目标基因设计的特异性引物（和探针，如TaqMan探针），在实时定量PCR仪上进行扩增和荧光信号监测。

   • 过程：与标准qPCR完全相同，通过分析Ct值来定量初始cDNA的量。

一步法RT-qPCR

• 原理：将逆转录和qPCR反应合并在一个试管、一步完成。使用同时具有逆转录酶活性和耐热DNA聚合酶活性的混合酶（或酶混合物），在同一个缓冲体系下，先进行低温逆转录，然后立即进入高温PCR循环。

• 优点：操作简便快捷，减少开盖步骤，降低污染风险和样本损失，适合高通量检测。

• 缺点：灵活性较差，cDNA产物无法保存用于其他基因分析，且通常成本更高。

关键实验设计与考量因素

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主要应用

1. 基因表达分析：这是其最核心的应用。定量检测不同生理/病理状态、组织、发育阶段、药物或环境刺激下，特定基因mRNA表达水平的差异。

2. microRNA与长链非编码RNA表达分析：使用特殊设计的茎环引物或加尾法进行逆转录，以检测和研究这些小分子或长链非编码RNA的功能。

3. 病毒RNA检测与载量测定：直接检测RNA病毒（如丙型肝炎病毒、流感病毒、SARS-CoV-2、HIV）的基因组或转录本，进行病原体诊断和病毒载量监测。

4. 转基因与基因敲除/敲低验证：验证细胞或生物体中转基因的表达水平，或评估RNA干扰、CRISPR基因编辑后目标基因的沉默效率。

5. 等位基因特异性表达分析：研究来自父母本等位基因的表达差异（基因组印记）。

优势与挑战

优势

• 极高的灵敏度与特异性：可检测单个细胞中几个拷贝的RNA分子。

• 宽动态范围：跨越7-8个数量级的线性检测范围。

• 高通量：可并行处理大量样本。

• 定量精确：可进行绝对或相对精确定量。

挑战与注意事项

• 标准化困难：从RNA提取、逆转录到qPCR的每一步都需严格标准化，否则结果变异大。MIQE指南为实验设计和报告提供了最低标准。

• 对抑制剂敏感：样品中残留的污染物（如胍盐、酚、肝素）会严重抑制逆转录酶或Taq酶活性。

• 内参基因的稳定性：选择不稳定的内参基因是导致错误结论的主要原因之一。

• 基因组DNA污染风险：引物设计时应跨越外显子-外显子连接区，以避开基因组DNA的扩增，并必须设置-RT对照。

• 逆转录效率：不同RNA的二级结构和逆转录引物会影响合成cDNA的效率，可能并非100%线性。

相关技术与标准

• 数字RT-PCR：将RT-qPCR与微滴或微孔板数字化技术结合，提供不依赖于标准曲线的绝对定量，对抗抑制剂能力更强，灵敏度更高，但通量相对较低。

• MIQE指南：为了确保RT-qPCR实验的可重复性和数据的可靠性，国际学术界提出了关于发表定量实时PCR实验的最低信息标准，强烈建议在实验设计和论文发表时遵循。

• RNA-seq：新一代测序技术，用于转录组分析，可以发现未知转录本和可变剪接，但在基因表达的精确定量和检测低丰度转录本方面，RT-qPCR仍有其独特优势。

参考文献

1. 奠基性方法与综述：Bustin, S. A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology. 2000, 25(2): 169-193. (系统阐述了RT-qPCR的绝对定量原理)。

2. 相对定量经典算法：Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^(-ΔΔCT) Method. Methods. 2001, 25(4): 402-408. (提出了被广泛采用的2^(-ΔΔCt)相对定量分析法)。

3. 实验标准化指南（MIQE）：Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 2009, 55(4): 611-622. (确保RT-qPCR数据可靠性的里程碑式标准文件)。

4. 内参基因选择与验证：Vandesompele, J., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology. 2002, 3(7): research0034. (提出了使用多个内参基因进行几何平均的标准化策略)。

5. 一步法与两步法比较：Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. BioTechniques. 2005, 39(1): 75-85. (全面比较了RT-qPCR的不同策略和注意事项)。