SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

SDS-PAGE 是一种基于蛋白质分子量差异进行分离的电泳技术，广泛应用于蛋白质纯度分析、分子量测定及Western blot前处理。其核心原理是通过SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质均一带负电荷，消除形状与电荷差异，使迁移率仅取决于分子量。以下是详细步骤、原理及注意事项：

1. 核心原理

• SDS作用：

  • 破坏蛋白质非共价键，使其线性化。

  • 结合蛋白质（1.4g SDS/g蛋白质），掩盖固有电荷，使所有蛋白质均一带负电。

• 还原剂作用：

  • β-巯基乙醇或DTT：断裂二硫键，彻底展开蛋白质。

• 分子量分离：

  • 小分子量蛋白质在凝胶中迁移更快，大分子量迁移更慢（凝胶孔径筛分效应）。

2. 实验流程

（1）试剂与材料

• 凝胶成分：

  • 分离胶（下层）：丙烯酰胺（8%-15%）、SDS、Tris-HCl（pH 8.8）。

  • 浓缩胶（上层）：低浓度丙烯酰胺（4%-5%）、Tris-HCl（pH 6.8）。

• 电泳缓冲液：Tris-Glycine（pH 8.3）+ 0.1% SDS。

• 样品处理：

  • 蛋白质样品 + 上样缓冲液（含SDS、还原剂、溴酚蓝指示剂），95℃煮沸5分钟。

（2）制胶步骤

1. 灌注分离胶：

   • 按比例混合丙烯酰胺、Tris缓冲液、SDS、APS（过硫酸铵）和TEMED，灌入制胶板至约2/3高度，覆盖异丙醇压平界面。

   • 聚合时间：20-30分钟（室温）。

2. 灌注浓缩胶：

   • 倒掉异丙醇，加入浓缩胶混合液，插入梳子。

   • 聚合时间：15-20分钟。

（3）电泳条件

• 电压设置：

  • 浓缩胶阶段：80-100V（防止产热过多导致条带扭曲）。

  • 分离胶阶段：120-150V（根据凝胶厚度调整）。

• 终止条件：溴酚蓝迁移至凝胶底部（约1-2小时）。

（4）染色与脱色

• 考马斯亮蓝染色：

  • 凝胶浸入染色液（0.1%考马斯亮蓝R-250，40%甲醇，10%乙酸）30分钟。

• 脱色：

  • 10%乙酸 + 40%甲醇溶液脱色至背景透明（更换脱色液数次）。

• 其他染色方法：银染（高灵敏度）、荧光染色（如SYPRO Ruby）。

3. 分子量标记与结果分析

• 预染Marker：
  常用Marker范围：10-250 kDa（如Thermo PageRuler）。

• 分子量计算：

  • 以迁移距离为横坐标，log(MW)为纵坐标绘制标准曲线，计算未知蛋白分子量。

• 软件分析：
  使用ImageJ或专业软件（如Bio-Rad Image Lab）定量条带强度。

4. 凝胶浓度选择

5. 常见问题与解决

6. 应用场景

• 蛋白质纯度检测：单一主条带提示高纯度。

• Western Blot前处理：分离后转膜进行抗体检测。

• 表达量分析：通过条带强度半定量目标蛋白表达水平。

• 分子量测定：比对Marker确定未知蛋白大小。

7. 注意事项

• 安全防护：

  • 丙烯酰胺单体具有神经毒性，操作时戴手套并在通风橱中配制溶液。

  • 避免接触SDS粉末（刺激眼睛和皮肤）。

• 重复性控制：

  • 保持制胶比例、电压、温度一致，减少批次差异。

• 样品保存：

  • 煮沸后样品可-20℃保存，避免反复冻融。

总结

SDS-PAGE是蛋白质研究的基石技术，其成功依赖于样品处理、制胶均一性及电泳条件优化。通过合理选择凝胶浓度、严格操作流程及规范数据分析，可高效实现蛋白质分离与表征。结合下游技术（如质谱或Western blot），进一步拓展其在生物医学研究中的应用价值。