不连续电泳
不连续电泳（Discontinuous Electrophoresis） 是一种通过使用不同缓冲系统和分层凝胶结构实现样品高效分离的电泳技术，其核心特点是通过电场、pH和凝胶孔径的梯度差异，使样品在迁移过程中先浓缩成窄带再分离，显著提高分辨率。以SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）为代表，广泛应用于蛋白质、核酸等生物大分子的分析。以下是其原理、步骤与应用的详细解析：
一、核心原理
1. 不连续体系构成
| 层级 | 成分与功能 |
|---|---|
| 浓缩胶（Stacking Gel） | - 低浓度聚丙烯酰胺（通常4-5%） - 低pH Tris-HCl缓冲液（pH 6.8） - 作用：形成低电场强度与高迁移率区域，将样品压缩成极窄条带。 |
| 分离胶（Separating Gel） | - 高浓度聚丙烯酰胺（根据目标分子量选择，如10-15%） - 高pH Tris-HCl缓冲液（pH 8.8） - 作用：基于分子量差异实现精细分离。 |
| 电极缓冲液 | - 含甘氨酸（Glycine）的Tris-Gly缓冲液（pH 8.3） - 通过pH与离子强度差异形成电导梯度。 |
2. 浓缩效应机制
离子迁移率差异：
在浓缩胶中，Cl⁻（快离子）、甘氨酸（慢离子，pH 6.8时带负电少）与蛋白质-SDS复合物（中等迁移率）形成速度梯度。
高电场下，Cl⁻快速迁移至前沿，甘氨酸滞后，蛋白质被压缩在两者之间形成薄层。
pH跃迁：进入分离胶（pH 8.8）后，甘氨酸解离度增加，迁移率提高，消除浓缩效应，蛋白质按分子量分离。
二、操作步骤
制胶：
依次灌注分离胶与浓缩胶，插入梳子形成加样孔。
分离胶聚合后覆盖浓缩胶溶液，避免界面扰动。
样品制备：
蛋白质样品与SDS、还原剂（如β-巯基乙醇）煮沸变性，形成均一带负电的SDS-多肽复合物。
电泳运行：
加样后，初始低电压（80-100 V）使样品通过浓缩胶，后调高电压（120-150 V）进行分离。
溴酚蓝指示剂迁移至胶底时停止。
三、关键优势
| 优势 | 说明 |
|---|---|
| 高分辨率 | 浓缩效应减少扩散，使条带更窄、分离更清晰（可区分相差1-2 kDa的蛋白质）。 |
| 高灵敏度 | 微量样品（μg级）仍可检测。 |
| 适用范围广 | 可调节凝胶浓度适应不同分子量范围（如5-200 kDa）。 |
| 兼容下游分析 | 便于转印（Western blot）、染色（考马斯亮蓝、银染）或质谱分析。 |
四、常见问题与优化
| 问题 | 原因与解决方案 |
|---|---|
| 条带弥散 | - 凝胶不均匀：确保聚合完全，避免温度波动。 - 电压过高：降低电压减少产热。 |
| 垂直条纹 | - 样品盐浓度过高：透析或稀释样品。 - 加样孔残留：冲洗加样孔。 |
| 前沿扭曲 | - 电极缓冲液pH错误：更换新鲜缓冲液（pH 8.3）。 - 凝胶与缓冲液接触不良：检查电泳槽密封性。 |
| 分子量偏差 | - SDS结合不均：确保充分煮沸与还原剂用量。 - 凝胶浓度选择不当：根据目标分子量调整。 |
五、应用领域
蛋白质纯度检测：评估纯化后蛋白质的均一性。
Western Blot前处理：分离蛋白质后转膜进行抗体检测。
临床诊断：分析血清蛋白（如多发性骨髓瘤的M蛋白）。
酶活性分析：通过活性染色（如zymography）检测酶谱。
六、与其他电泳技术的对比
| 技术 | 连续性 | 分辨率 | 典型应用 |
|---|---|---|---|
| 不连续电泳 | 不连续缓冲系统 | 极高 | 蛋白质分子量测定、精细分离 |
| 连续电泳 | 均一缓冲系统 | 中等 | 核酸分析、快速筛查 |
| 等电聚焦（IEF） | pH梯度 | 极高（按电荷） | 蛋白质等电点测定 |
总结：不连续电泳通过巧妙的缓冲系统与凝胶设计，将浓缩与分离过程解耦，成为生物大分子分析的黄金标准。其高分辨率与可扩展性使其在基础研究、医学诊断及生物工程中不可或缺。掌握其原理与优化技巧，可显著提升实验效率与结果可靠性。
附件列表
词条内容仅供参考，如果您需要解决具体问题
（尤其在法律、医学等领域），建议您咨询相关领域专业人士。