个体间距

个体（配子）DNA序列PCR分析是高等生物遗传图谱构建的重要方法。传统遗传图谱依赖于选择性杂交后代的分析或家系分析法来计算连锁关系，对人类而言仅后者可行。使用长度多态性限制片段（RFLPs）在构建人类连锁图谱方面已取得长足进步。为了对带有与已知表现型相关的RFLP标记的基因进行定位，首先需建立间隔约10 cM的遗传标记束（平均1 cM等于1%重组），这样没有基因离标记RFLP的距离会超过5 cM。可靠的统计表明，家系分析能够检测的遗传间距精确到1 cM（1 cM相当于1000 kb的DNA）。分析更小的遗传间距需检测家族内大量个体，实际难以实现。

最近发展了一种不依赖遗传杂交或家系分析的方法来检测遗传标记间的重组频率。具体方法是直接决定配子（精子）的基因型是亲本型还是重组型。这通过确定两个等位基因中哪一个存在于双杂合男性精子上的两个基因座其中之一来完成。根据上述方法确定的重组精子数量除以总检测精子数，即可估计出重组频率。已知聚合酶链式反应（PCR）在体外扩增基因能够使DNA扩增10⁹倍，因此该技术有可能分析精子中单分子靶DNA。以这种方式研究数千个人精子，就有可能构建比家系分析精确得多的遗传图谱。该方法提供了一个独特的手段来研究许多现在被认为是不能解决的人类遗传学领域的难题。

从人类家系分析的观点来看，每个个体都是亲本减数分裂产生的单个产物的融合体。双亲以及后代体细胞DNA的研究加上适当的统计学方法，可推知形成合子的减数分裂产物的重组或非重组性质，同时可以估计重组在减数分裂中所占的比例。我们研究遗传重组的方法与上述不同，它通过分析减数分裂产物本身的DNA来决定减数分裂发生重组的比率。每个男性一生中可产生大量的减数分裂产物——精子，从而提供了进行遗传分析取之不尽的实验材料。

假设一个男性杂合子有两个连锁基因座。每一个基因座的多态性差异在于AT-AT或GC-GC）要么是重组型（AT-GC或GC-AT）。重组类型出现的频率将取决于两个基因座彼此间的遗传间距。通过检测某一个体的大量精子，可精确计算出四种精子类型出现的频率。该技术存在的困难在于确定减数分裂前细胞中的每个基因座上存在的两种等位基因中的哪一个进入单个精子。常规的分子生物学技术没有足够高的灵敏度分析精子染色体DNA的单个分子。

PCR扩增与ASO探针检测

PCR扩增每个基因座的多态性区域是分析精子的第一步。两个基因座用两组引物，同时引物必须位于多态性区域的边侧。当精子两个靶序列经PCR扩增，就确定了每个基因座的等位基因成份。人工合成的寡核苷酸探针可识别等位基因小到仅发生单个碱基置换的实验方法已得到改进，这些等位基因特异的寡聚物（ASO）探针第一次应用是将人正常β珠蛋白基因中的正常βA等位基因与镰刀形红细胞（βS）的突变区分开来。本方法检测等位基因需要人工合成的小片段寡核苷酸（典型的长19 bp）。每个寡核苷酸与一个等位基因完全互补而与另一个等位基因通常只有一个碱基的差别。同位素标记的寡核苷酸分别与待检测扩增的DNA样品杂交。在适当的杂交条件下，只有样品中的序列完全互补时，寡核苷酸可形成稳定的双螺旋。例如，精子的PCR产物用四种ASO探针分析。有一对ASO分别将基因座1的两个等位基因区别开，另一对将基因座2的两个等位基因区别开。实际上，预期两个ASO中只有一个与某一个减数分裂产物杂交，可以确定每个检测的精子对于所研究的染色体而言实际上是单倍体。

人单倍体细胞有1.5-5×10⁻²⁴摩尔单一DNA序列。根据以前的实验结果，我们知道活性达5 μCi/微微摩尔的同位素标记就能够在不到一天的时间内检测出1毫微微摩尔（10⁻¹⁵/10⁻²⁴）。即使以较低的平均扩增效率，大约经50个扩增循环便可完成。

单个二倍体细胞

在分析单精子以前，Li等人对个体二倍体细胞内的β珠蛋白基因进行过研究。两个组织培养细胞株用于这些实验。其中一个纯合是镰刀型细胞密码子6（βS）发生突变，另一个纯合子则来源于正常的βA等位基因。扩增含有密码子6的β珠蛋白片段的引物，及能够区别这两个特异的等位基因的寡核苷酸探针（ASO）已经报道过。βA纯合细胞和βS纯合细胞在同一组织培养瓶中共同培养数天。将用相差显微镜观察到的混合培养的单个细胞转入薄塑料管内。分别将单个细胞转入含裂解液的PCR管中，保温后，加入PCR缓冲液，缓冲液中有四种dNTP、Taq DNA聚合酶和扩增已知珠蛋白基因的PCR引物。95℃10分钟变性靶DNA，然后根据已发表方法的改进方案进行50个循环的扩增。通过打点杂交，等量的扩增产物打点于尼龙膜后，扩增产物分别与βA和βS的探针杂交。所分析的37个细胞中，84%细胞只与βA或βS探针杂交，杂交强弱各不相同；19个与βA探针，12个与βS探针杂交。12个以水作空白对照的反应管中反应呈阴性，表明可忽略不计DNA的污染。没有与两种探针都杂交的样品，暗示转入到反应管中的是单个细胞，而且组织培养基中存在的从βA或βS细胞中裂解出来的DNA并未吸附在单个细胞上。

单个细胞的PCR扩增产生的β珠蛋白基因的数量通过与已知携带珠蛋白基因的质粒DNA样品在杂交膜上的杂交信号强度进行比较确定。据估计，PCR反应开始时，一个二倍体细胞珠蛋白DNA量（3.0×10⁻²⁴摩尔）在5-500毫微微摩尔之间，每个PCR循环以平均效率65%计算，经50个循环后其DNA相当于平均扩增了7.6×10¹⁰倍。考虑到扩增的程度之大，因此排除任何可能的污染对于单个细胞的分析十分关键。

单精子的分析

Li等人随后对位于染色体19编码LDL受体（LDLr）的基因的杂合体单精子的基因型进行分析。根据已知的DNA序列，他们用PCR和ASO分析检测LDLr的RFLP。PCR的引物和探针以前已有报道。单个精子的分离与二倍体细胞的分离方法一样，精液经蔗糖梯度离心得到纯化的精子，精子于-20℃可保藏8个月。显微镜下将单个精子吸入毛细塑料针管内，然后转入试管内以作裂解。裂解的方法与发表的方法一致：缓冲液（50 mM KCl，10 mM Tris·HCl，pH 8.3，2.5 mM MgCl₂，0.1 mg/ml明胶），0.05 mg/ml蛋白酶K，20 mM DTT和1.7 μM SDS。37℃保温1小时，加入PCR反应物以前，样品加热到85℃。PCR扩增。对80个精子LDLr基因型已作过分析。55%的雄配子显示出杂交信号。22个携带LDLr1等位基因，21个携带LDLr2基因。仅一个与两种探针杂交都呈阳性。16支对照反应管中加入所有反应试剂但没有精子，结果无杂交信号出现。两个扩增的等位基因的分布遵循孟德尔独立分离定理，表明PCR反应以单个减数分裂产物为起始，无污染的二倍体DNA存在。

Li等人随后又对进行重组研究十分关键的单精子的两个不同基因座的DNA序列进行扩增。供体雄配子的第六条染色体上的HLA DQα基因座及第十九条染色体上的LDLR基因是杂合的。最初想在LDLR和DQα引物存在的条件下同时扩增两个基因座的全序列的努力未能成功。取而代之，在两对引物存在时，先扩增20个循环，经这种最初扩增以后，将1/50反应混合物加入试管内，用只含HLA引物的PCR缓冲液稀释，另一份同等量的反应混合物经只含LDLR引物的PCR缓冲液稀释，再进行45个扩增循环以后，用第二次反应产物的一部分与具有等位基因位点特异的两个ASO杂交。123个样品（85%）有杂交信号。剩下的27个样品无扩增位点。123个样品中有9个至少发现在两基因座其中之一有两个等位基因，而对这些样品未作进一步的分析。这些样品中可能有不同基因型的两种精子，而不是由于减数分裂连锁造成的。因为最近细胞学有关人精子的研究结果表明单个染色体的平均连锁频率在0.1%水平，远远低于所观察到的频率。

在剩下的114个精子中，LDLR基因座有96个已经定型，其中45个为LDLR1，51个为LDLR2。两等位基因的比率理论值为1:1（方差=0.375，0.75>p>0.5，1 df）。88个的DQα等位基因的分离处于具有统计学意义的临界值（方差=3.68，0.1>p>0.05，1 df）。上述结果表明：1）统计上的不稳定性；2）由于该基因座具有大量的多态性，PCR引物与供体DQαDNA序列之间的错配导致两个DQα等位基因不均等扩增；3）一些异常的遗传现象如异常分离。

基于单精子PCR和ASO探针的技术为遗传图谱构建提供了前所未有的精度，可检测小于1 cM的遗传间距，弥补了传统家系分析的局限。该方法在人类遗传学、连锁分析、重组研究及疾病基因定位中具有重要应用前景。未来随着高通量测序和微流控技术的发展，单精子分析有望实现大规模自动化，进一步推动精准遗传图谱的构建。

• Li, H. H., et al. (1988). Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature, 335(6189), 414-417.
• Saiki, R. K., et al. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230(4732), 1350-1354.
• Donis-Keller, H., et al. (1987). A genetic linkage map of the human genome. Cell, 51(2), 319-337.
• Lander, E. S., & Botstein, D. (1989). Mapping mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics, 121(1), 185-199.
• 李克勤, 等. (1990). 人类遗传图谱的构建与单精子分析技术. 遗传, 12(5), 36-40.
• 陈竺, 等. (1998). 医学遗传学. 北京: 人民卫生出版社, 第2版.