原位测序

一、核心定义与起源

原位测序（In Situ Sequencing, ISS）是一类空间分辨率测序技术，直接在完整组织切片/细胞原位对核酸（DNA/RNA）进行扩增、测序与信号读取，不经过组织解离与核酸提取，保留基因表达的空间位置信息，实现分子序列与空间坐标的精准关联。 ADFASDFAF23RQ23R

2004年，Larsson团队首次提出基于锁式探针+滚环扩增的原位基因分型，为原位测序奠定基础；2014年后，FISSEQ、STARmap、MERFISH等技术快速发展，推动其成为空间转录组/空间基因组学的核心工具，广泛应用于神经科学、肿瘤病理、发育生物学等领域。 ADSFAEQWER353423413434

二、三大核心研究方向

1. 原位测序技术体系优化

优化锁式探针设计、滚环扩增效率、荧光编码体系；降低组织自发荧光背景、提高信噪比；开发高兼容、自动化实验流程，适配石蜡、冰冻多种临床样本，突破通量、分辨率、灵敏度技术瓶颈。

ADFASDFAF23RQ23R

2. 细胞空间异质性解析

依托原位测序亚细胞分辨能力，解析肿瘤、脑组织、胚胎组织内部细胞空间排布、细胞邻接关系、局部微环境差异；挖掘细胞间相互作用、空间特异性表达特征，弥补单细胞测序丢失空间信息的缺陷。 ADSFAEQWER353423413434

3. 临床病理与多组学转化应用

结合免疫染色、空间蛋白组、单细胞测序，构建形态-基因-蛋白多维病理分析体系；开发疾病原位分子分型、标志物筛选、预后评估模型，推动原位测序走向临床常规病理诊断。

ADSFAEQWER353423413434

三、关键技术进展

1. 探针与扩增技术

基于锁式探针特异性识别靶序列，依靠滚环扩增（RCA）在原位生成微米级扩增产物，实现信号放大；改良高保真连接酶，大幅降低错配率，提升测序准确度。 ADFASDFAF23RQ23R

2. 高通量荧光编码测序

采用多轮荧光连接测序、纠错编码，实现上百种RNA并行检测；MERFISH通过二进制编码、误差校正，极大提高检测通量，成为高分辨空间转录组主流技术。 ADSFAEQWER353423413434

3. 组织透明化与水凝胶固定

通过组织透明化、水凝胶交联固定核酸，降低组织散射，维持三维结构；实现脑组织、肿瘤组织三维原位测序，拓展空间检测维度。

ADSFAEQWER353423413434

4. 生物信息可视化分析

开发空间拼接、细胞分割、表达图谱映射算法；构建空间表达热力图、细胞空间轨迹图，实现原位测序数据可视化、定量化、标准化分析。

ADFASDFAF23RQ23R

四、应用前景

1. 肿瘤病理精准诊断

解析肿瘤空间异质性、肿瘤微环境免疫细胞分布；原位检测驱动基因突变、融合基因、耐药靶点；实现肿瘤精准分型、分级、预后评估，辅助免疫治疗与靶向治疗用药决策。 ADSFAEQWER353423413434

2. 神经科学脑图谱构建

绘制大脑神经元空间分布图谱，区分神经元亚型；解析神经环路基因调控规律；揭示阿尔茨海默病、帕金森病病理分子原位分布特征，为神经退行性疾病提供新靶点。

ADFASDFAF23RQ23R

3. 发育生物学研究

追踪胚胎、器官发生过程中基因时空表达模式；解析干细胞分化、细胞迁移、组织建成的空间调控规律，完善发育时空调控网络。 ADFASDFAF23RQ23R

4. 空间多组学联合分析

联合单细胞测序、空间蛋白组、表观组，建立原位多维组学体系；实现核酸、蛋白、修饰信息在同一组织原位叠加分析，深度解析细胞微环境调控机制。 ADSFAEQWER353423413434

五、生物安全与伦理

1. 生物安全风险

人体组织样本存在生物感染风险，切片、孵育、扩增流程需严格生物安全管控；高灵敏扩增技术易造成微量外源核酸污染，需严格设置空白对照，防止实验误差；荧光染料、扩增试剂具有轻微细胞毒性，废弃样本需合规无害化处理。 ADSFAEQWER353423413434

2. 伦理规范问题

临床人体组织样本采集需严格遵循知情同意、匿名化处理原则；原位测序获得的人体基因空间数据属于高度隐私生物信息，禁止私自共享、商用；禁止利用原位测序技术开展人类胚胎基因编辑、非医疗目的人体基因检测，严守生命伦理红线。

ADFASDFAF23RQ23R

六、总结

原位测序作为新一代空间组学核心技术，打破传统测序必须裂解提取核酸的限制，在完整组织原位完成核酸测序，保留细胞真实空间位置、邻接关系与微环境特征，弥补了单细胞测序丢失空间信息的短板。依托滚环扩增、荧光编码、组织透明化等技术革新，原位测序实现亚细胞分辨率、多基因并行检测、多类型样本兼容，广泛应用于肿瘤病理、神经图谱、胚胎发育、空间多组学研究。目前该技术仍存在检测通量有限、设备昂贵、数据分析复杂、成本偏高的技术瓶颈。未来需不断优化探针设计、扩增体系、成像算法，降低检测成本，建立临床标准化流程，推动原位测序从科研基础研究走向临床病理诊断、精准医疗、疾病预警，成为生命科学与临床医学不可或缺的前沿分析工具。