组织培养

植物组织培养的原理是植物细胞具有全能性，取植物的部分组织或者单个细胞，在合适的培养基上经培育可以长成一株完整的植物。

植物细胞的全能性

植物细胞的全能性即是每个植物的本细胞或性细胞都具有该植物的全套遗传基因，因此在一定培养条件下每个细胞都可发育成一个与母体一样的植株。


（一）增加遗传变异性，改良作物

（二）繁殖植物

（三）有用化合物的工业化生产

（四）种质储藏
植物组织培养
http://www.jlau.edu.cn/jiaowu/jpk/jpk/id6_xxzd_33.asp
植物组织培养是把植物的器官，组织以至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下，能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化作用”，已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化作用”。植物激素在此过程中起着重要的作用，吲哚乙酸（ IAA ）和 6 –苄基氨基腺嘌呤（ 6 – BA ）的比例，决定了根和芽的分化。

近年来，组织培养作为一种研究技术，已广泛地应用于许多学科中，它不仅对理论研究有重要意义，并已展现了十分广阔的应用前景。

一、原理

植物组织经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。早在 1957 年 Skoog 即发现培养基中植物激素的类型和它们的比例，对再分化过程起着重要的作用。

二、试剂与仪器设备

（一）试剂

? 乙醇。

?  IAA 或 2 ， 4 – D 。

?  HgCl 2 （或次氯酸钠）。

?  6- 苄基氨基腺嘌呤（ 6-BA ）

?  MS 培养基（见附录）。

（二）仪器设备

培养室，高压灭菌锅，水浴锅，解剖刀，三角烧瓶（ 100mL ），烧杯，量筒，培养皿，棉线，接种箱或超净工作台，分析天平，长镊子，剪刀，容量瓶，移液管，牛皮纸。

三、实验步骤

1. 配制培养基

（ 1 ）愈伤组织诱导培养基： MS 培养基（蔗糖含量为 10 g/L ， 2,4 – D 含量为 2 mg/L ，琼脂 10 g/L ）。

（ 2 ）试验培养基：在 MS 培养基中按表 33 – 1 加入 IAA 和 6–BA 。

吲哚乙酸先用少量 0.1 mol/L NaOH 溶解， 6- 苄基氨基腺嘌呤先用少量 0.1 mol/L HCl 溶解，然后用蒸馏水稀释，再加入培养基中。

                     表 33 – 1 试验培养基中 IAA 和 6 – BA 含量

序号
IAA （ mg/L ）
6-BA （ mg/L ）
相对比值

1
0
2.0


2
0.2
2.0
1:10

3
0.5
2.0
1:4

4
1.0
2.0
1:2

5
2.0
2.0
1:1

6
2.0
1.0
2:1

7
2.0
0.5
4:1

8
2.0
0.2
10:1

9
2.0
0



2. 培养基灭菌

将配好的培养基加入琼脂加热溶解，调至 pH 5.8 ，趁热分装于 100 mL 三角烧瓶中，每瓶约 20 mL 。待培养基冷却凝固后，用一层称量纸和一层牛皮纸包扎瓶（管）口，并用棉线扎牢，然后在高压灭菌锅中 121 ℃（ 1 kg/cm 2 ）下灭菌 20 min 。取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。接种操作所需的一切用具（如长镊子、解剖刀、剪刀等）及灭菌水，需同时灭菌。

3. 诱导产生愈伤组织

（ 1 ）取健壮的烟草茎数段，每段约 5 cm 长，于烧杯中用 0.1% 氯化汞（升汞）浸泡 20 min ，取出用无菌水洗 3 ～ 4 次，置于无菌培养皿中，在接种箱中按无菌操作要求剥去外皮（接种箱事先用紫外灯灭菌 30 min ），用解剖刀切成 5 mm 厚的圆片（弃去开始一片和最后一片），用长镊子将它接种在诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶接种 4 片，接种后扎好瓶口。

（ 2 ）将已接入植物组织（外植体）的三角烧瓶，培养在 25 ℃温室中，每星期检查 l ～ 2 次，剔除材料已被杂菌污染的三角烧瓶， 3 ～ 4 周后产生愈伤组织。

（ 3 ）选取愈伤组织生长良好的三角烧瓶，用解剖刀将愈伤组织切下，转移到含有不同激素的试验培养基中（也可以连同原来的外植体一起转移），每瓶放 1 ～ 2 块，仍培养在 25 ℃温室中，每周 1 ～ 2 次观察不同处理的三角烧瓶中，愈伤组织分化情况，直至长出根和芽。长成的幼小植株即为“试管苗”，可移栽于花盆中。