重组DNA

重组DNA实验recombinantDNAexperlm-ent
　　这是从生物体提取的DNA片断或人工合成的DNA，在试管内通过酶等的作用人工地结合于质体或病毒等的自我增殖性DNA，导入细胞内使之增殖的一种实验，也是用根据这种方法得到的重组DNA分子的实验。是70年代急剧发展起来的技术，为与过去的在活体上利用遗传重组的杂交实验等相区别，所以特称为重组DNA实验。把使与载体结合的DNA称为供体DNA，提取供体DNA的生物称供体生物，而将接受重组DNA的细胞称寄主。由于此技术之发展，使高等生物的特定基因在大肠杆菌内等增殖成为可能（称为DNA克隆繁殖），与同一时期发展起来的DNA碱基排列顺序决定法互相补充，可能成为对基因结构进行细致分析。另外，在自然界中对不可能进行的异种主物间的基因重组体的形成也成为可能，为生物学的基本原理及应用的研究带来了飞速的进展。

         从细菌或动植物细胞中取出染色体的DNA，用内切酶将之切成若干片段，从中鉴定出目的基因。另一种方法是从细胞中分离到信使核糖核酸核(mRNA)用反转录酶的作用获得该基因的互补DNA(cDNA)。如果预先知道某种蛋白质的氨基酸顺序，可以破译它的遗传密码，用DNA合成的方法获得基因。

      运载体一般为质粒，是细菌中染色体以外的DNA。但它不是正常的成分，即没有质粒也完全可以正常生长。质粒是环状的DNA，能自主复制，有若干内切酶切口和某些抗生素的抗药性基因。可以作为转基因的载体。

      将目的基因与质粒DNA如pBR322质粒，用相同的内切酶分别进行切割，结果它们都会形成相同的切口。

      DNA连接酶，常用的有T4。在三磷酸腺苷(ATP)及镁离子存在的条件下，T4连接酶能将切口相同的两种DNA连接起来，形成一个插入目的基因的质粒，叫重组质粒。

      宿主菌如大肠杆菌作为受体菌，需要培养到旺盛生长阶段，叫感受态细胞。一般在液体培养基中，37℃振荡培养过夜即可。

       将插入目的基因的质粒加入呈感受态的大肠杆菌中，同时加入适当的钙盐(Ca+2)，振荡培养。大肠杆菌将重组质粒吞入胞内。这个过程叫转化。

       pBR322质粒的PstI酶切口处插入目的基因时，则会破坏了抗氨苄青霉素的基因。将转化后的大肠杆菌单个菌落，挑取菌体分别接种于含氨苄青霉素及链霉素的培养基中。如在链霉素培养基上生长而在氨苄青霉素培养基上不能生长的菌落即为转化子。