限制酶

‌限制酶（Restriction Enzymes）详解‌

‌1. 定义与来源‌

• ‌定义‌：限制酶（限制性内切酶）是一类能够识别特定DNA序列并在特定位点切割双链DNA的酶，主要来源于细菌，用于防御病毒（噬菌体）入侵。
• ‌命名规则‌：以来源菌命名，如EcoRI（来自Escherichia coli R株，I表示首个分离的酶）。

‌2. 分类与特性‌

• ‌I型‌：识别特定序列，切割位点远离识别位点（约1000 bp外），需ATP供能（应用较少）。
• ‌II型‌：‌最常用‌，识别4-8 bp回文序列（如EcoRI：GAATTC），切割位点在识别序列内，无需ATP。
  • ‌粘性末端‌：切割后产生单链突出（如EcoRI产生5'-G↓AATTC-3'）。
  • ‌平末端‌：切割后无突出（如SmaI：CCC↓GGG）。
• ‌III型‌：识别非对称序列，切割位点邻近识别位点，需ATP（应用较少）。

‌3. 作用机制‌

• ‌识别与切割‌：通过结合特定DNA序列，诱导双链断裂。
  • ‌粘性末端‌：便于DNA片段互补连接（如克隆载体与插入片段）。
  • ‌平末端‌：连接效率低，需T4 DNA连接酶或末端修饰（加接头）。

‌4. 关键应用‌

• ‌DNA克隆‌：切割载体和目的基因，通过连接酶重组。
• ‌基因编辑‌：结合CRISPR-Cas系统，精确切割目标位点。
• ‌RFLP分析‌：通过酶切图谱差异研究遗传多态性。
• ‌合成生物学‌：组装合成基因或代谢通路。

‌5. 实验注意事项‌

• ‌缓冲条件‌：不同酶需特定pH、离子强度（如高盐、中盐、低盐缓冲液）。
• ‌双酶切‌：选择兼容缓冲液或分步酶切。
• ‌热灭活‌：部分酶需65°C加热20分钟灭活（避免后续反应干扰）。
• ‌甲基化影响‌：宿主甲基化可能抑制酶切（如dam/dcm甲基化），需选用甲基化不敏感酶。

‌6. 特殊类型‌

• ‌同尾酶（Isocaudomers）‌：不同酶产生相同粘性末端（如BamHI和BglII）。
• ‌同裂酶（Isoschizomers）‌：不同酶识别相同序列但切割位点不同（如SmaI和XmaI）。

‌7. 商业化与储存‌

• ‌供应商‌：New England Biolabs（NEB）、Thermo Fisher、Takara等。
• ‌储存‌：-20°C保存，避免反复冻融（可稀释后分装）。

‌8. 前沿发展‌

• ‌工程化限制酶‌：改造酶识别位点或切割特性。
• ‌超高保真酶‌：减少非特异性切割，适用于长片段组装。
• ‌与CRISPR联用‌：增强基因编辑的特异性与效率。

‌9. 经典案例‌

• ‌pBR322质粒克隆‌：用EcoRI和HindIII双酶切插入外源基因。
• ‌人类基因组计划‌：利用限制酶绘制基因组物理图谱。