原位杂交

原位杂交（in situ hybridization）是将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，从而在细胞或组织中定位特定核酸序列的技术。该技术常用于检测与探针互补的DNA或RNA链在细菌、真核细胞等样本中的位置。探针可以是DNA或RNA，标记物包括放射性同位素（如³²P）、荧光染料或地高辛等。 ADSFAEQWER353423413434

菌落原位杂交适用于对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200个）进行克隆筛选。具体步骤包括：

• 菌落转移至滤膜：在含选择性抗生素的琼脂平板上放置硝酸纤维素滤膜，用无菌牙签将菌落转移至滤膜，并在主平板对应位置接种。同时接种非重组质粒菌落作为对照。
• 培养与标记：倒置平板，37℃培养至菌落生长至0.5-1.0 mm宽度；用注射器针头穿透滤膜与琼脂，在不对称位置做标记以定位。
• 主平板保存：用Parafilm膜封好主平板，4℃倒置贮存直至获得杂交结果。

裂解菌落使DNA释放并结合于硝酸纤维素滤膜：

• 将滤膜菌落面朝上放在0.5 mol/L NaOH的保鲜膜小洼上处理2-3分钟，重复一次。
• 吸干后，用1 mol/L Tris·Cl（pH 7.4）处理两次，每次5分钟。
• 再用1.5 mol/L NaCl、0.5 mol/L Tris·Cl（pH 7.4）处理5分钟，干燥后于80℃真空烘箱中干烤2小时固定DNA。

固定后的滤膜与³²P标记探针杂交：

• 预杂交：在预杂交液中于适宜温度（水溶液中68℃，50%甲酰胺中42℃）预杂交1-2小时。
• 探针变性：双链探针100℃加热5分钟，冰浴冷却后加入杂交袋中杂交过夜。
• 洗涤：依次用2×SSC/0.1% SDS室温洗涤两次，1×SSC/0.1% SDS 68℃洗涤两次，必要时用0.2×SSC/0.1% SDS 68℃洗涤。
• 放射自显影：滤膜晾干后，与X光片和增感屏在-70℃曝光12-16小时，显影后比对鉴定阳性菌落。

下表总结了不同洗涤条件的应用： ADSFAEQWER353423413434

• Sambrook, J., Fritsch, E. F., & Maniatis, T. (1989). 分子克隆实验指南（第2版）. 科学出版社.
• Gall, J. G., & Pardue, M. L. (1969). Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences, 63(2), 378-383.
• Jensen, E. (2014). Technical review: In situ hybridization. The Anatomical Record, 297(8), 1349-1353.
• Levsky, J. M., & Singer, R. H. (2003). Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. Journal of Cell Science, 116(14), 2833-2838.