单克隆抗体

1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在细胞杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高滴度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。

这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题，可用于探讨①蛋白质的精细结构；②淋巴细胞亚群的表面新抗原；③组织相容性抗原；④激素和药物的放射免疫（或酶免疫）分析；⑤肿瘤的定位和分类；⑥纯化微生物和寄生虫抗原；⑦免疫治疗和与药物结合的免疫-化学疗法 (“导弹”疗法,利用单克隆抗体与靶细胞特异性结合，将药物带至病灶部位。因此，单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景。
（一）融合剂
细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4000者，常用浓度为50％，pH8.0～pH8.2（用10％NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。50％浓度，pH偏碱时融合效应最高。也有采用30%～50％浓度的PEG加上10％二甲亚砜。不同批号的PEG，即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的，一般选供气相色谱用的PEG。

（二）融合过程
融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。3:1或5:1最为常用。
1．试剂与材料
(1)供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。
(2)1640培养液100ml。
(3)完全1640液100ml。
(4)2.5％FCS－1640液50ml。
(5)HAT培养液100ml。
(6)50％PEG：取分子量4000，高纯度的（日本进口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。
(7)10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。
(8)40孔塑料培养盘。

2．操作方法
⑴准备好脾细胞。
⑵在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml2.5％FCS－1640液。
⑶室温400g离心3min，使细胞沉淀。
⑷移去上清液。
⑸轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40℃水浴中，使其达融合温度。
⑹加预热至40℃的50％PEG0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续2min。
⑺加1ml1640液，边加边摇动，持续1min。
⑻重复⑺一次。
⑼加1ml1640液，边加边摇动，持续0.5min。
⑽重复⑼一次。
⑾加1640液15ml。
⑿室温，400g离心1min，使细胞沉淀。
⒀去上清，轻敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。
⒁往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液，每孔1滴（约0.05ml）。
⒂轻摇后，放入5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育。
⒃第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。
⒄于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体。
⒅对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS－1640液。同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。

（三）细胞融合的关键
1．技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。
２．融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。
克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100~1000倍。
利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。
1．材料
（1）经高压灭菌的降植烷。
（2）Balb/c鼠：5~8周龄。
（3）杂交瘤细胞：取对数生长期的细胞。
（4）RPMI—1640培养液
（5）新生牛血清

2．操作方法
(1)于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后１～９周内种植细胞。
(2)收取对数生长期的杂交瘤细胞，用５％FCS—1640液洗涤一次，1000r/min离心10min。
(3)取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用５％FCS—1640液配成1.0×107细胞/ml的悬液。
(4)给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml（含1.0×107个细胞/ml）。
(5)接种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔1~3天取1次，可取10次。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。
1．材料
(1)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液
20mMol/LNaCl
(2)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液
40mMol/LNaCl
(3)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液
80mMol/LNaCl
(4)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液
(5)饱和硫酸铵液
(6)DEAE—纤维素柱

2．操作方法
（1）小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后，于1.00×105转离心30min，去沉淀。
（2）在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为50％硫酸铵浓度。
（3）此溶液置冰中30min~60min，然后5000r/min离心10min，去上清。
（4）将沉淀溶于Tris－HCl缓冲液（40mMol/LNaCl）中（溶液可能混浊）。
（5）装入透析袋于Tris－HCl缓冲液（20mMol/LNaCl）中透析除盐。
（6）离心去沉淀。
（7）溶液稀释（1:100或更高倍稀释）后，于280nm测蛋白含量，估计蛋白质含量1A280unit=0.8mg蛋白质一般每ml腹水中，含有总蛋白约25mg~36mg。
（8）过DEAE—纤维素柱：纤维素柱高40cm，以20mMol/LNaClTris缓冲液平衡。透析样品以Tris缓冲液等量稀释。

样品进入柱床速度为1ml~2ml/min，以NaCl线形梯度洗脱。大部分单克隆IgG于40mMol/L和80mMol/LNaCl洗脱，也有极少例外的单克隆抗体于120mMol/L~150mMol/LNaCl洗脱。测OD280nm收集蛋白峰，单克隆IgG保存备用。
杂交瘤产生各种免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪种为主，则决定于抗原的免疫程序。免疫一次，且3天后就取脾，多为产生IgM的B淋巴细胞。免疫多次的多为IgG。 1．杂交瘤细胞染色体的检查采用秋水仙素裂解法进行。

2．单克隆抗体的类型、亚型的测定：购买兔抗小鼠Ig类型和亚型的标准抗血清，采用琼脂扩散法或ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型。

3．单抗的特异性鉴定可以采用各种方法，如免疫荧光法、ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等，同时还需做免疫阻断试验等。

4．单抗的效价测定可采用凝集反应、ELISA或放射免疫测定。不同的测定方法效价不同。培养上清液的效价远不如腹水的效价。采用凝集反应，腹水效价可达5×104。而采用ELISA检查，腹水效价可达1.0×106。单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。

5．必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。
经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要3～5次克隆才能稳定。克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。
（一）有限稀释法
1．材料
（1）微量培养盘，盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞（即饲养细胞）每孔2万～4万。
（2）HT培养基
2．操作方法
（1）取出抗体阳性孔细胞，用HT培养液制成细胞悬液。并取样进行台盼兰染色，计数。
（2）用HT培养液将细胞稀释成200个/ml、40个/ml、20个/ml和的悬液。
（3）用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔0.05ml，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。
（4）5％CO2饱和湿度，37℃培养。
（5）每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。
（6）克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3～1/2时，测培养液抗体。
（7）抗体阳性孔细胞，移到有饲养层的组织培养瓶中，并传2～4代就可以脱离饲养细胞，建成克隆株。

（二）软琼脂克隆化
借助撒在软琼脂上单个细胞定位生长，而达到克隆化，具体操作如下：
1．配2.5％的琼脂糖30ml，水浴溶化后，移入45℃水浴中。
2．将117ml完全DMEM液和3ml10倍浓度的DMEM液混合，置45℃水浴预热。
3．将琼脂糖与DMEM液混合，即为含0.5％琼脂糖的完全DMEM液，并加75×108脾细胞。
4．每块平皿加10ml，于室温中凝固。
5．DMEM中的细胞与DMEM—琼脂1:1混合，将细胞琼脂混合物2ml铺于凝固的平板上，使其全部覆盖。
6．放入CO2箱饱和湿度，37℃培养10天。
7．用PBS配制0.6％琼脂糖，于沸水浴溶解后，置45℃，在保温情况下取一试管，迅速加入0.1ml25％羊红血球，0.2ml豚鼠补体，2.7ml0.6％琼脂糖。
8．用3ml琼脂糖—羊红血球混合液覆盖克隆。于37℃CO2箱孵育1h~2h。从克隆上部溶解羊红血球的溶血范围，可筛选抗羊红血球Ig。

（三）显微镜操作法
在直径6cm培养皿中，加入1ml1.0×108细胞悬液放置5％CO2饱和湿度，37℃温箱中放置30min以上，倒置显微镜下，寻找那些与周围相距甚远的单个细胞，将毛细管口（一头有直角弯头毛细管，一头连接一尺长乳胶管，用口控制液体进入）水平置放于液面上，左右微动，直到看见管口，对准细胞，吸入毛细管，将管中细胞移到预先加有2.0×104~5.0×104饲养细胞96孔板内，培养后，即可获得单个细胞形成的克隆。

（四）荧光激活分离法
用一种荧光激活细胞分类器（FluoresceinActivafedCellSorter，FACS）。其基本原理是：将细胞经荧光抗体染色后，经喷嘴形成单个细胞的线形液滴，在莱塞光激发下，荧光素发射荧光，此信号由光电倍增管接收，再结合细胞形态大小产生光散射信号，经电脑处理，产生信号并与预定的信号对比，根据细胞荧光强度及细胞大小不同，将细胞分成不同级别，在电场中发生偏离，而分别收集于不同容器中。
（一）脾细胞
1．材料
(1)免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠。
(2)1640培养液
(3)2.5％FCS－1640营养液
2．操作方法
(1)拉颈或用CO2处死小白鼠。
(2)将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。
(3)把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。
(4)用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。
(5)直立小试管3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。
(6)以2.5％FCS—1640充满离心管，并以400g离心7min～10min（与此同时应开始制备骨髓细胞）。
(7)把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。
(8)重复⑹、⑺步骤。
(9)计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。

（二）骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。
选择骨髓瘤细胞的条件：①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；②骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml；④生长速度快，繁殖时间短。常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（简称SP2）；③P2—X­—Ag8·6·5·3（简称653）；④FO以653最为常用，它是由矿物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（MinerolOilplasmacytoma，MOPC）并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理。为了防止出现返祖现象，在融合前，可将培养基内加入15μg/ml8－氮鸟嘌呤。取约1×107～6×107对数生长期（即培养15h～20h）的骨髓瘤细胞，在室温离心（400g）10min，沉淀以2.5％FCS—1640液再悬浮并计数。

（三）饲养细胞
在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feedercell）。在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。
1．材料
（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只。
（2）11.6％蔗糖溶液（经10磅30min高压灭菌）。
2．操作方法
（1）拉颈处死小鼠。
（2）70％酒精浸泡消毒10min。
（3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。
（4）用注射器将4ml11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。
（5）1000r／min离心10min。
（6）取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含40万个活细胞。
（7）以1ml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2万个细胞，放入CO2培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。

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