DNA疫苗

    DNA疫苗：不同于传统的疫苗，DNA疫苗旨在将病原微生物的某种专门组分的裸露DNA编码直接注入机体内。尽管此类疫苗尚未面世，但其在技术上的飞速发展有可能开创免疫学的新纪元。目前正在研制的此类疫苗包括疟疾、流感、轮状病毒、HIV等。 

DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，是编码免疫原或与免疫原相关的真核表达质粒DNA(有时也可是RNA)，它可经一定途径进入动物体内，被宿主细胞摄取后转录和翻译表达出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激机体产生非特异性和特异性2种免疫应答反应，从而起到免疫保护作用。

DNA疫苗能诱导细胞免疫和体液免疫。
消除导入可能与"减毒"疫苗相关的强毒力病毒的危险性。
使用一次，即能产生长期免疫力，无须增加剂量，并可提高依从性。
多个病原体的基因可装在同一个质粒上，减少了疫时多次注射的不适。
DNA可以干粉形式保存数年，且仍保持起活性。

①DNA接种载体(如质粒)的结构简单，提纯质粒DNA的工艺简便，因而生产成本较低，且适于大批量生产；②DNA分子克隆比较容易，使得DNA疫苗能根据需要随时进行更新；③DNA分子很稳定，可制成DNA疫苗冻干苗，使用时在盐溶液中可恢复原有活性，因而便于运输和保存；④比传统疫苗安全，虽然DNA疫苗具有与弱毒疫苗相当的免疫原性，能激活细胞毒性T淋巴细胞而诱导细胞免疫，但由于DNA序列编码的仅是单一的一段病毒基因，基本没有毒性逆转的可能，因此不存在减毒疫苗毒力回升的危险(Davis等，1999)，而且由于机体免疫系统中DNA疫苗的抗原相关表位比较稳定，因此DNA疫苗也不象弱毒疫苗或亚单位疫苗那样，会出现表位丢失(Donnelly等，1999)；⑤质粒本身可作为佐剂，因此使用DNA疫苗不用加佐剂，既降低成本又方便使用(Babiuk等，1999)；⑥将多种质粒DNA简单混合，就可将生化特性类似的抗原(如来源于相同病原菌的不同菌株)或1种病原体的多种不同抗原结合在一起，组成多价疫苗，从而使1种DNA疫苗能够诱导产生针对多个抗原表位的免疫保护作用，使DNA疫苗生产的灵活性大大增加。 

1 伪狂犬病病毒(PRV) 将编码PRVgC或gD基因的质粒DNA免疫猪，能诱导保护性抗体的生成和细胞免疫的产生；将编码gB、gC、gD的多种质粒DNA混合使用，对引导免疫反应更有效
2 猪流感病毒(HIV) Mackling等(1998)的试验结果表明，编码HIV1株的血凝素(HA)和核衣壳蛋白(NP)质粒DNA用金颗粒包裹，以基因枪轰击猪的表皮进行免疫后，HA质粒DNA能使猪产生粘膜免疫反应而对流感病毒的攻击具有抵抗力，DNA疫苗引起的免疫反应与灭活疫苗相当。
3 猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRS) PRRS基因片段ORF5编码的主要囊膜糖蛋白GP5是该病毒的3个主要结构蛋白之一。含有ORF5基因质粒DNA能诱导猪抗GP5特异性中和抗体的产生；且免疫猪的外周血单核细胞在GP5重组蛋白存在时能够发生转化反应，显示了GP5特异性细胞免疫的产生(Pirzadeh B等，1998)。Meng(2000)将GP5基因克隆入巨细胞病毒(CMV)早期启动子的控制之下构建成真核表达质粒而制备出DNA疫苗，用其免疫仔猪后可诱导抗体的产生，实验室攻毒后显示出良好的保护效果。
4口蹄疫病毒(FMDV) 将FMDV全长基因组的cDNA克隆到质粒，并去除其编码核衣壳蛋白VP1的细胞结合部位的DNA序列，构建成质粒DNA以肌肉或皮内注射，初次免疫后2～4周，可使所有的猪都产生特异的病毒中和抗体，攻毒试验中呈现部分保护作用 
5猪瘟病毒(CSFV) 余兴龙等(2000)构建了CSFV主要保护性抗原E2基因4种不同的真核表达质粒。小鼠免疫试验结果表明，E2基因上不同的功能区对基因疫苗的免疫应答有很大影响，有信号肽序列的E2基因可诱导特异性的免疫反应，且无跨膜区序列的E2基因所诱导的免疫应答反应比有跨膜区序列的强，而无信号肽序列的E2基因所诱导的免疫应答反应比有跨膜区序列的强，而无信号肽序列的E2基因则不能诱导产生CFSV特异性的免疫反应。攻毒保护试验结果表明，免疫家兔最少可抵抗10个最小感染剂量(MID)的猪瘟兔化弱毒苗(HCIV)的攻击；免疫猪可抵抗致死剂量的CFSV石门株强毒的攻击。 
6 牛呼吸道合胞体病毒(BRSV) 用BRSV G基因构建的DNA疫苗，以无针方式免疫小牛时比皮内或肌肉注射引起的免疫反应强烈。
牛疱疹病毒(BHV) 用表达BHV?1 gD基因的质粒DNA疫苗免疫牛，能产生很高的中和抗体；攻毒试验后发现，免疫组比非免疫组的病毒排放量明显减少(schrijver R S等，1997)。此疫苗通过肌肉或皮内注射均可引导免疫反应的产生。但皮内注射引起的免疫反应更强
7 牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 以表达BVDV1型主要糖蛋白E2的质粒DNA肌肉注射小牛，可产生病毒中和抗体和抗原特异的细胞增殖反应；免疫后16周进行攻毒试验，发现免疫牛能产生针对BVDV1型和2型的血清中和抗体强烈的记忆抗体反应，对牛有部分免疫保护作用
8新城疫病毒(DNV) Sakaguchi等(1996)将NDV F基因插入质粒载体，F基因的表达受巨细胞病毒早期增强子和鸡β?肌动蛋白启动子控制。1周龄试验鸡肌肉内注射重组质粒后，有2/5注射线性质粒的鸡和4/5注射线性质粒与脂质体转染剂混合物的鸡产生了高水平针对F蛋白的抗体，而注射闭环状质粒的鸡不能产生抗体。免疫9周后，体内有抗体的试验鸡都能抵抗致死剂量NDV强毒的攻击。
9鸡传染性喉气管炎病毒(ILT) 将分别构建的含有鸡传染性喉气管炎病毒王岗株gB、gC和gD基因的重组真核表达质粒及空载体质粒分组注射雏鸡，攻毒后观察免疫保护效果。结果表明，重组质粒诱导了免疫应答，免疫保护率达到79%，该基因疫苗可以作为预防ILV的1个补充。
10禽流感病毒 Robinson等(1993)最先将DNA疫苗用于鸡，以编码禽流感病毒H7N7株血凝素(HA)基因的质粒(DNA)由不同途径(静脉、腹腔、皮下注射)免疫3周龄鸡，可对致死剂量的H7N7株病毒鼻内攻击产生50%的保护。Fyna等(1993)为了研究DNA疫苗对鸡最有效的免疫途径，将100～200 μg编码H7?HA的质粒DNA通过静脉、肌肉、皮下注射、点眼、囊内、滴鼻等方式免疫3周龄鸡。4周后进行第2次免疫。第6周，用致死剂量的H7N7攻击，免疫鸡的存活率达10%～63%，而对照组的存活率只有2%。其中，多种途径如静脉和肌肉注射共同免疫的效果，比单一途径如肌肉注射、点眼、法氏囊内、滴鼻免疫效果好。Kodihalli等(1997)将编码H5?HA的质粒DNA以0.25、0.5、1.5或10 μg用基因枪免疫鸡，4周后以100LD?50的Ty/lre/83株鼻内免疫进行攻击，低至0.25 μg剂量的DNA可使50%的免疫鸡存活。而1、5、10 μg的剂量可完全抵抗致死剂量病毒的攻击。DNA疫苗对致死剂量的抗原变异株也可提供95%的保护，证实DNA流感疫苗具有广阔的发展前景。

直接肌肉注射
注射的DNA在肌肉细胞中以环型分子存在，不能复制，并不能整合到宿主细胞染色体中。肌肉细胞中特有的横管系统与细胞外空间有直接交通，因而可能介导质粒 DNA的内吞作用。而且横纹肌中溶酶体和DNA酶的含量较低，可能也是质粒DNA能在细胞中存在较长时间的原因。
微离子轰击介导的DNA免疫
即基因枪。其技术依据是亚微粒的钨和金能自发地吸附DNA，将包裹有金粉或钨粉的 DNA 质粒，借助高能电场以极快的速度轰击动物表皮组织，能获得满意的免疫效果。

目前，DNA疫苗尚未得到广泛的应用，除了因为它是一种新事物，不大为人所了解之外，它本身的安全问题则是人们对它 的最大顾虑。DNA疫苗存在的问题如下：
外源DNA进入机体后是否整合到宿主基因组，导致癌基因激活或抑癌基因失活。
疫苗DNA长期在体内表达是否会诱导机体产生免疫耐受，长远来说，导致机体免疫功能低下。
疫苗DNA 作为一种外来物质，是否会引起机体产生抗DNA抗体。
DNA疫苗诱导的CTL反应是否会对其他细胞产生杀伤作用。

目前，DNA免疫接种的领域正在迅速发展，已经发展的现行疫苗不仅使用DNA，而且还包括附加物，它有助于DNA进入靶细胞，或者起到佐剂的作用，刺激或诱导免疫应答。首先获准上市的核酸疫苗，很有可能是采用菌体细胞衍生的DNA质粒。在将来，其他类型的疫苗也可能采用RNA或用核酸分子和其他成分的复合物。提高DNA疫苗的免疫效果将是今后研究的主要方向，此外，质粒DNA的接种剂量、途径、程序及是否使用佐剂也可影响免疫反应效果。
已有的研究表明，DNA疫苗不仅有可能预防病毒、细菌或寄生虫，同时也可能作为感染性疾病、肿瘤等的治疗性疫苗。但是，DNA疫苗作为外源DNA是否可能会与宿主染色体整合?是否会干扰宿主基因的功能?是否会诱发宿主细胞恶变或自体免疫反应，例如诱生DNA抗体等，尚待澄清。相信随着研究的深入和技术上的改进，DNA疫苗将会为人类造福。